话说青霉素

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人物小传：孙万儒，中国科学院老科学家科普演讲团副团长；中国科学院微生物研究所研究员，博士生导师，中国科学院研究生院教授；中国生物工程学会继续教育工作委员会主任、工业与环境委员会委员，中国生物化学与分子生物学学会工业生化委员会委员，中国微生物学会酶与酶工程委员会委员。

主要从事酶学、酶工程、基因工程和生化工程研究。参与我国北方生物工程中试基地筹备和建设工作，主持国家重点科技攻关项目、国家自然科学基金重大项目、中国科学院重大项目6项。

目前研究重点是利用基因工程、蛋白质工程、酶工程解决手性药物与手性化合物的生物合成问题，取得多项重要成果。获国家发明奖、科技进步奖，中国科学院奖多项。发表论文90余篇，专著4本。2004年获得“北京市科普先进工作者”和“中国科学院科普先进工作者”奖励。

一、被埋没的偶然发现

1928年9月的一天早晨，在英国伦敦圣玛丽医学院担任细菌学讲师的弗莱明（A.Fleming）像往常一样来到了实验室。在实验室里一排架子上，整齐地排列着很多玻璃培养皿，里面分别培养着各种有毒的细菌。弗莱明正在寻找一种能够制服它们，或把它们变成无毒菌的方法。其中有一种在显微镜下看起来像葡萄状，存在很广泛，能够使伤口感染化脓的葡萄球菌。弗莱明试验了各种药剂，力图找到一种能杀它的理想药品，但是一直没有成功。

弗莱明

弗莱明来到架子前，逐个检查着培养皿中细菌的变化。当他拿起靠近窗户的一只培养皿的时候，他皱起了眉头，自言自语道：“唉，怎么搞的，竟然变成了这个样子！”。原来，这只贴有葡萄球菌标签的培养皿里的培养基发了霉，长出一团青色的霉斑。

他的助手赶紧过来说：“这是被杂菌污染了，别再用它了，让我倒掉它吧。”弗莱明没有马上把这培养皿交给助手，而是仔细观察了一会儿。他惊奇发现，在青色霉菌斑的周围，有一小圈空白的区域，原来生长的葡萄球菌消失了。难道是这种青霉菌的分泌物把葡萄球菌杀灭了吗？想到这里，弗莱明兴奋地把它放到了显微镜下进行观察。结果发现，青霉菌附近的葡萄球菌已经全部死去，只留下一点痕迹。

他立即决定，把青霉菌进行培养。几天后，青霉菌明显繁殖起来。于是，弗莱明用一根湿线蘸上葡萄球菌，放到青霉菌的培养皿中，几小时后，葡萄球菌全部死亡。接着，他分别把带有白喉菌、肺炎菌、链球菌、炭疽菌的线放进去，这些细菌也很快死亡。但是放入带有伤寒菌和大肠杆菌的线时，这两种细菌照样繁殖。

为了试验青霉菌对葡萄球菌的杀灭能力有多大，弗莱明把青霉菌培养液加水稀释，先是一倍、两倍……最后以八百倍水稀释，结果它对葡萄球菌和肺炎菌的杀灭能力仍然存在。这是当时人类发现的最强有力的一种杀菌物质了。

可是，这种青霉菌液对动物是否有害呢？弗莱明小心地把它注射进了兔子的血管，然后紧张地观察他们的反应，结果发现兔子安然无恙，没有任何异常反应。这证明这种青霉菌液体没有毒性。

通常，在培养微生物时发生这种情况并不奇怪，这叫污染了杂菌。因为在我们周围的空气中漂浮着各种各样的微生物，如细菌、真菌、酵母，甚至于病毒等，即使经过过滤、消毒、灭菌，仍然不会全部去除，有时在接种时还会有的落在培养基上，培养后长成菌落。按照常规做法，如果不影响实验结果，可以忽略；如果有影响，要重新进行实验。

弗来明没有按常规进行处理，他仔细观察、验证，才有了青霉素的发现。弗莱明发现青霉素虽然代有偶然性，但是如果不具备严禁的科学态度和追求探索精神也不会有发现，同样前人的经验、知识的积累也给他以莫大的启示。因此任何重大发现都是必然的偶然，这种偶然只留给那些有心人。

1929年6月，弗莱明把他的发现写成论文发表。他把这种青霉菌分泌的杀菌物质称为青霉素。

人们向他祝贺。英国一位显贵建议他申请制造青霉素的专利权，那样将来就会发大财。弗莱明经过考虑，写信婉言拒绝了那位显贵的建议。他说：“为了我自己和我一家的尊荣富贵，而无形中危害无数人的生命，我不忍心。”

由于青霉素具有抑制细菌的能力，对动物无害，他建议用这种青霉菌培养液作局部外敷来治疗溃疡一类的皮肤感染。但是因为青霉素在培养物中的含量太少，没有办法大量制备供给使用。还由于当时人们正热衷于磺胺药物研究，把希望寄托在正在风靡的磺胺药物上。更重要的是1932年克鲁德布科（Clutterbuck）和1935年瑞德（Reid）根据弗莱明的发现，对青霉菌的培养物也进行了研究，并提取了青霉素，他们发现在水溶液里青霉素性质不稳定，在室温下放置时间长了就会破坏，失去杀菌作用。因此，认为不适合用作抗感染性疾病的药物，也不值得进行深入地化学与生物学的研究。因此，人们就这样把青霉素放弃了。

二、重新燃起的希望

人类20世纪的上半叶多灾多难，战争频发，疾病流行，因为无药救治造成大量死亡。1939年第二次世界大战爆发，造成大量伤员，在战场上没有死，但因为感染无法控制，许多伤病员在痛苦的煎熬中死去，为拯救伤员性命，急需大量的抗感染药物进行救治。

于是人们又想到既然青霉素可以杀死葡萄球菌，就有可能杀死能使人致病的细菌。在牛津大学主持病理研究工作的澳大利亚病理学家佛罗理（H.W.Flory）和德国的生物化学家钱恩（E.B.Chian），仔细阅读了弗莱明关于青霉素的论文，对这种能杀灭多种病菌的物质产生了浓厚的兴趣。但是他们知道，要提取出这种物质，需要各方面科学家的共同努力。他邀请了一些生物学家、生物化学家和病理学家，组成了一个联合实验组。这之中，德国生物化学家钱恩是他最主要的得力助手。

三、希望变为现实

这时佛罗理清醒地意识到，为使青霉素能广泛地用于临床治疗，满足战争的需要，必须改进方法和设备，进行大规模生产。但这对联合实验组来说非常困难。当时伦敦正遭受德国飞机的频繁轰炸，要进行大规模生产也很不安全。1941年6月，佛罗理不顾钱恩的反对，带着青霉素样品来到不受战火影响的美国。他马上与美国的科学家们开始合作。经过共同努力，终于研究成以玉米汁为培养基，在24℃的温度下进行发酵的方法和设备，提炼出的青霉素，纯度和产量有了大幅度提高。在1943年实现了青霉素的工业化生产，从而很快开始了在临床上的应用。

霍华德·瓦尔特·佛罗理（Howard.Walter.Florey）（1898-1968）

青霉素制备最早还采用过固体表面培养法，就是使用麸皮、豆饼粉、玉米粉等固体物与水混合制成的固体培养基经过加热灭菌，冷却后与青霉菌菌种液体混合，放到浅盘里，再将盛有发酵物的浅盘摆放在室内的架子上，保持室内温度和湿度，并经常的翻动，进行发酵。发酵结束后，用水将产生的青霉素由固体培养基中浸提出来，制成干粉。这个生产过程与过去农村使用原始的制曲发酵生产酱油、醋类似。使用这样的非常原始的生产方法虽然可以生产出青霉素产品，但是存在许多问题。

为了获得足够量的青霉素，需要大量的培养基和培养室，占用的厂房非常大，这也使得温度和湿度很难控制；工人在又热又潮的培养室里，劳动强度非常大，十分辛苦。更重要的是在发酵过程中，为了通气，培养基是暴露在空气中，空气中的各种微生物会造成大量污染，无法做到纯种发酵，使得每一次的发酵结果都不相同，很难控制发酵过程，生产的产品的质量也无法保障。象这样的问题还有很多，因此，当时利用表面培养法生产青霉素的水平很低，发酵酵价只有40多单位/毫升，提取收率只有20%，产品纯度为20%，而且成本很高。按现在对医药产品质量要求，这样的产品很难作为药物使用。

因此，迫使人们探索新的生产方法。1942年液体深层发酵法研究成功。所谓液体深层发酵是指与固体表面培养相反，使用液体培养基在固定的容器内发酵。液体培养基是相对于固体培养基而言，液体培养基中水的含量达到80～90%，而固体培养基的固体物占60～70%，水占30～40%。液体培养基中可能是完全溶解的营养物质，也可以含有一定数量的固体物营养物。

因为青霉菌生长和产生青霉素需要氧气，发酵过程必需通入大量的空气满足它们的需要。而通入普通的空气是不行的，因为空气中存在大量的微生物，进入发酵液中会大量繁殖，造成污染，甚至喧宾夺主，使发酵遭到破坏。因此，必须彻底地清除通入的空气中的所有微生物。一般是通过加压升温，冷却除水，多次无菌过滤等方法来实现。这就需要一套制备无菌空气的设备和工艺。

另外，空气中的氧气在水中的溶解速度和量十分有限，为了满足青霉菌生长和产生青霉素的需要，要加快氧的溶解速度和提高发酵液中的氧浓度。为解决这个问题，除了加大通气量外，更重要的是将通入的空气气泡打碎、变小。对于同一体积的空气来说，只有气泡越小，空气与液体的接触面积越大，氧气在发酵液中的溶解速度越快，才可满足菌体的需要。为了实现这一目的，首先要将进入发酵罐的空气尽可能的分散成较小的气泡，然后再通过搅拌打成更小的气泡，这就需要精益求精的不断完善设计，改造设备。

搅拌在发酵过程中还有改善物质和热量传递的作用，使发酵物料混合均匀，防止局部温度过高，提高加热和冷却效率等。但是，搅拌不当，也有负面作用，比如打断菌丝，伤及细胞，影响细胞的正常代谢和青霉素的合成。因此，为了提高搅拌效率，降低负面影响，对搅拌器的形状、大小、位置、个数，以及产生的混合方式都有严格要求。影响混合效率的还有发酵罐的形状、径高比，挡板的形状、数量、设置位置、形态等等。这就涉及发酵罐和辅助设备的设计和加工等一系列的工程设备问题。

对于任何一种微生物来说，它们生长和合成产物时都需要一个适宜的温度范围，就象我们人一样温度高了、低了都不行。我们可以通过增减衣服，开空调、暖气来解决。对于微生物我们没有办法给它们穿衣服，但可以采用类似开空调、暖气的方法解决。就是在发酵罐上加上用于冷却和加热的夹套和螺旋管，通过通入冷水或热水进行冷却或加热，维持发酵温度。

另外，为了保证纯种发酵，也就是只保证能够产生青霉素的一种青霉菌生长，而不允许其他微生物生长、污染，在接种产生青霉素的青霉菌之前，要对使用的发酵罐及附带的设备和培养基进行灭菌、把其中存在的所有微生物全部杀死，防止将杂菌带入发酵系统。通常对培养基和发酵设备进行消毒灭菌都是使用高温灭菌法，即通入高温高压蒸汽进行消毒。灭菌之后还需要进行冷却，使温度降到适合微生物生长。微生物在生长、代谢旺盛时会产生大量发酵热，使温度升高，这时需要对发酵系统进行冷却，保持适宜的发酵温度；发酵后期，微生物生长缓慢，发酵热产生减少，甚至停止，进行产物合成时又需要维持适当温度，这时又需要进行适当加热保温。为了在不同发酵阶段保持适宜的温度。所以必须有加热和冷却装置和控制系统。

发酵结束，产生的青霉素还在发酵液中，必须进行分离。首先要进行过滤，将发酵液中的固体物质，比如菌体和没有消耗掉的固体营养物组分除去，将滤液用酸调成酸性，使青霉素成为青霉素酸，然后用有机溶剂乙酸丁酯进行萃取，将青霉素萃取到有机溶剂中，达到分离的目的，经脱色，再用碱性水从含有青霉素的有机溶剂反萃取出来，使青霉素变成盐，重新溶到水中，经过浓缩，进行结晶，经过干燥，就可以得到青霉素产品。

为了满足青霉素发酵和提取的这些条件，就必须解决与之有关的技术，设备和工艺问题。为此人们根据对青霉素发酵过程认识的不断深入，不断地研究和发展了可通入无菌空气、利用夹套和套管通入冷、热水控制温度的密封搅拌式发酵罐，以及配套的其他设备，如空气压缩、过滤、灭菌设备，以及相应的生产工艺和技术。使青霉素的生产从上个世纪40年代初的发酵效价每毫升200单位，提取收率75%，产品纯度为60%的水平的基础上不断提高。也使发酵所需的厂房占地面积、劳强度、能源消耗、原材料、成本等大大降低，为青霉素在临床上的大量使用奠定了基础。（未完，待续。）