蜘蛛头胸部钙含量与其活动能力的相关性研究

摘要:以拟环纹豹蛛头胸部为材料,利用微波消解法对其进行处理,采用火焰原子吸收光谱(FAAS)法对样品中的总钙离子含量进行检测,分析不同温度下蜘蛛头胸部钙、镁离子含量的变化;同时采用田间调查法研究拟环豹纹蛛在不同温度下空间生态位宽度的变化。试验结果表明:在一定范围内,随着温度的升高,蜘蛛头胸部Ca2+含量升高,导致神经冲动传递速度加快,范围加广,新陈代谢加强,活动力及兴奋性加强,空间生态位幅度变宽。

关键词:拟环纹豹蛛;头胸部;钙含量;活动能力

中图分类号 Q599;Q593+.6 文献标识码A文章编号 1007-5739(2010)11-0157-03

StudiesonCorrelationbetweenContentofCa2+inSpiders’CephalothoraxandItsActiveAbility

LIAO Yan-Yang 1JIN Chen-zhong 2HE Ai-lan 2

(1 Orient Science & Technology College,Hunan Agricultural University,Changsha Hunan 410128;2Hunan Institute of Humanities,Science and Technology)

AbstractUsing Pardosa Pseudoannulata’s cephalothorax as materials,flame atomic absorption spectrometry(FAAS)method was conducted to determine the general content of Ca2+in samples,and to analyze the correlation between different temperature and specific contents of Ca2+ and Mg2+ in the spider. Simultaneously,the value changes of spatial niche breadth ofthe spider under different temperatures were determined through the method of field survey. The results showed that the content of general Ca2+ increases markedly with the increasing of temperature in a certain range,and it leaded to faster and broader transmission of nerve impulses,and metabolism activity and excitement of strengthening,widenning value changes of spatial niche breadth were enhanced.

Key wordsPardosa Pseudoannulata;calcium content in cephalothorax;active abitity

基金项目 国家自然科学基金(30300041)。

作者简介 廖艳阳(1974-),女,湖南湘潭人,硕士,讲师,主要从事生物化学与分子生物学研究工作。

收稿日期 2010-05-07

拟环纹豹蛛(Pardosa Pseudoannulata)是农田蜘蛛中的重要优势种群,其体形大、空间生态位宽、捕食力强,对稻飞虱的捕食量为8～12头/d,因此在害虫防治中起着重要的作用[1]。自从1883年Ringer发现蛙心在不含钙的液体中停止搏动至今,Ca2+在细胞活动中的作用引起了人们的广泛注意。细胞内游离Ca2+浓度的改变是细胞生理功能的重要物质基础,也是多种受体激动后信号传递过程中的中心环节。细胞内游离Ca2+浓度的变化是Ca2+跨膜转运和细胞内钙池摄取、释放钙等过程动态平衡的结果[2]。在免疫信息研究中,已经证实钙通过钙神经硷(钙依赖性磷酸酶)而发挥作用,钙浓度的变化可调节该种磷酸酶的活性,从而调控整个免疫反应的过程及其速度[3]。本试验主要通过测定不同温度下蜘蛛头胸部钙离子的变化,来进行钙离子与蜘蛛活动能力相关性的研究。

1材料与方法

1.1试验材料

供试拟环纹豹蛛来自湖南农业大学水稻试验田,共60只,投入直径为2.5 cm试管进行单只培养,将这些试管分别置于35、25、15、5、0 ℃环境下培养3 d,每个温度下8只。供试仪器为:WMX-Ⅲ-A型CODcr、TN、TP微波闭式消解仪;TAS-986原子吸收分光光度计;微量进样组件;Ca2+空心阴极灯;Mg2+空心阴极灯;电子天平;恒温恒湿培养箱;冰箱;恒温烤箱;离心机。供试试剂和标准溶液:浓硝酸(分析纯),双氧水(分析纯),考马斯亮蓝G-250(Fluka公司产品);5,5’-二硫双硝基苯甲酸(DTNB)(Roth公司产品);毒扁豆碱(化学纯)(上海化工总厂产品),配制Ca2+标准溶液0.1 mg/mL,配制Mg2+标准溶液0.005 mg/mL。

1.2样品制备

1.2.1Ca2+、Mg2+待测液制备。蜘蛛样品用超纯水反复冲洗,截取蜘蛛头胸部在60 ℃烘箱中烘干至恒重,然后用研钵磨碎样品至均匀粉末状备用。参考动物样品消解方法及王水锋等所做的微波消解探索试验方案[4-5],消化罐清洗处理干净后,准确称取研细筛分的试样0.010 g于消化罐中,加浓HNO3 5 mL、30% H2O2 5 mL,采用程序消解方法,开罐为无色透明溶液,用去离子水定容至25 mL。加盖摇动混匀,供测Ca2+、Mg2+用。另配制HNO3 5 mL+H2O2 5 mL,用去离子水定容至25 mL,作为空白样品。

1.2.2乙酰胆碱酶(AChE)源制备。AChE的制备参照蒋传葵等方法[6],并作适当修改。将水稻田中抓到的拟环纹豹蛛成蛛用流动的蒸馏水冲洗,然后放在滤纸上吸干,置于匀浆器中,加入1 mL冰冷的0.067 moL/L(pH值7.2)磷酸盐缓冲液(PBS),在冰浴中慢慢研磨至匀浆。在0~4 ℃下以4 000 r/min离心15 min,取上清液用作酶源。

1.3标准系列溶液配制

Ca2+ 标准使用液配制:吸取Ca2+标准使用液0、0.50、1.50、2.50 mL,分别于50 mL容量瓶中,各加去离子水稀释定容至刻度,配成Ca2+浓度分别为0、0.001、0.003、0.005 mg/L;吸取Mg2+标准使用液0、0.10、0.30、0.50 mL,分别于50 mL容量瓶中,加去离子水稀释定容至刻度,配成Mg2+浓度0、0.001、0.003、0.005 mg/L的标准系列[7]。AChE标准曲线的制作:取30(6×5)支具塞试管,编号后,按表1加入试剂。盖上塞子,摇匀。放置2 min后在595 nm波长下比色测定(比色应在 l h内完成)。以乙酰胆碱酶蛋白含量(μg)为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘出标准曲线[8]。整个试验应该在蛋白质标准液制备1 h内完成,以避免产生误差。

1.4测定方法

1.4.1Ca2+、Mg2+待测液测定。首先,参照表2条件,将仪器调整至最佳工作状态。按照下列条件进行测量计算:测量状态Ca、Mg用原子吸收方式[9]。计算峰高;计算时间为10 s;延迟时间为10 s;重复次数为2次;统计只求平均数;时间常数为0.2 s;标准曲线:ABS =(CONC)一次方程。其次绘制标准曲线。将待测元素的标准系列溶液依次取150 μL加入微量进样组件导入原子吸收分光光度计中,测定吸光度(或发射强度),标准系列测定完毕后,仪器自动计算回归方程,打印相关系数(2种元素r>0.999 7),绘制标准曲线。然后进行样品测定。吸取150 μL样品稀释液(或空白液)加入微量进样组件导入原子吸收分光光度计火焰中,测定吸光度(或发射强度),仪器根据校准曲线计算并打印待测元素含量。最后计算结果。利用公式:

ρ(待)=■(1)

式(1)中,ρ(待)为样品中待测元素质量浓度(mg/mL);ρl为样品测定液中待测元素质量浓度(mg/L);ρB为空白样品中待测元素质量浓度(mg/L);V为样品测定液定容体积(μL);Vl为取样体积(μL)。

1.4.2样品中AChE含量测定和AChE比活力的测定。称取约1 mL上述上清液倒入10 mL容量瓶,再加入蒸馏水,定容至刻度。取1支具塞试管,准确加入0.1 mL样品提取液,再加入0.9 mL蒸馏水,5 mL考马斯亮蓝G-250试剂,充分混合,放置2 min后,以标准曲线1号试管作参比,在412 nm波长下比色,记录吸光度。根据所测样品提取液的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(μg),按下式计算:

样品蛋白质含量(μg/g鲜重)=(查得的蛋白质含量(μg)×提取液总体积(mL))/(样品鲜重(g)×测定时取用提取液的体积(mL))(2)

AChE比活力的测定参照文献[6],并作适当修改。以乙酰胆碱为底物,反应体系总体积为3.0 mL。取0.1 mL的酶液,加入0.1 mL 0.8 moL/L的碘化硫代乙酰胆碱(ATch)和0.7 mL的0.067 moL/L的PBS(pH值8.0)缓冲液,于30 ℃下反应30 min后,加入0.3 mL 0.001 moL/L毒扁豆碱,随后再加入0.01 moL/L 1.8 mL DTNB-磷酸盐-乙醇试剂(12.4 mg DTNB、120 mL 96%乙醇和80 mL 蒸馏水以 0.2 moL/L pH值7.5 PBS缓冲液定容至250 mL)终止反应,于412 nm处测OD值。

1.5蜘蛛空间生态位的调查

以一块面积为1 000 m2左右的农田为取样地,5点取样,每样方为20丛。从土表开始,把植株划分为基部(离土面5 cm左右)、茎部和叶面3个资源状态,调查和统计各样方不同资源状态内的蜘蛛的种类和数量[10];同时在人工气候箱内在不同温度下进行模拟试验。生态位宽度,采用Levins的计算公式:

B=■∑Pi2(3)

式(3)中,B为物种的生态位宽度;Pi为物种利用第i等级资源占利用总资源的比例;S为资源序列的等级数。其中1/S≤B≤1,1/S表示物种仅利用资源序列中的一个等级;1表示物种以完全相同的比例利用每一个等级。

2结果与分析

2.1不同温度下Ca2+、Mg2+含量变化

由表3可知,随饲养温度的升高,蜘蛛头胸部中Ca2+含量逐渐增加,35 ℃时Ca2+含量最高,且35 ℃>25 ℃>15 ℃>5 ℃>0 ℃。这可能是随饲养温度的增加,新陈代谢旺盛,肌肉活动能力增强的缘故。Ca2+信号通过激活多种Ca2+依赖的蛋白激酶、磷酸酶、蛋白酶,发挥Ca2+信号的级联放大作用,导致神经冲动传递速度加快,范围加广,蜘蛛新陈代谢加强,活动力及兴奋性加强。

由表4可知,随着饲养温度的升高,蜘蛛头胸部Mg2+含量逐渐减小,Mg2+与去氢酶的结合率高低影响冬眠和冬眠消素的分泌。随温度的升高,蜘蛛体内Mg2+与去氢酶结合率升高,加上作为细胞内第二信使的Ca2+运载电流,激活体内代谢变化,导致Mg2+含量随温度的增加而递减。

2.2不同温度下AChE比活力及其动力学比较

由表5可知,拟环纹豹蛛随温度的升高而AChE活性降低。乙酰胆碱酯酶的活性越高,对乙酰胆碱的分解越强,那么蜘蛛的兴奋性就越弱,反之亦然。拟环纹豹蛛在长时间处于5 ℃或更低温度下会开始冬眠,此时通过试验结果可以发现,进入冬眠时期后,乙酰胆碱酶活性增加,对乙酰胆碱的分解越强,导致蜘蛛活动能力降低。由于进入突触后膜发挥生理作用后,就被突触后膜上的胆碱酯酶水解成胆碱和乙酰而失去活性。而这一点随着温度升高而显得更加明显,拟环纹豹蛛具有不耐热的特性,处于35 ℃或更高温度下难以生存,可能就是这个原因。从整个温度变化来看,进入冬眠时期的蜘蛛的AChE活性最高,15 ℃下饲养的次之,35 ℃或更高温度下的最低,说明在不同的温度变化阶段,AChE活性存在较大差异。

2.3不同温度下拟环纹豹蛛空间生态位变化

由表6可知,随着温度的降低,蜘蛛的空间生态位开始变窄。其中,35 ℃>25 ℃>15℃ >5 ℃>0 ℃,35 ℃时空间生态位最广,25 ℃时次之,0 ℃时空间生态位几乎没有改变,可能是由于蜘蛛处于冬眠期,故5 ℃时空间生态位最窄。这说明随着温度的降低,拟环纹豹蛛的生物活动性变低,这可能与拟环纹豹蛛体内Ca2+含量逐渐降低及蜘蛛体内AChE活性的变化有关。通过与表3对比可知,拟环纹豹蛛体内乙酰胆碱作用于膜受体后,导致钙离子通道开放,去极化打开钙通道,使胞外Ca2+沿着钙通道内流,触发突触小泡与突触前膜融合,将递质释放到突触间隙。在神经递质的作用下,拟环纹豹蛛体内的活动性相关的酶活性随之变化,随温度的降低,神经递质AchE被降解,神经兴奋性减弱,于是出现了空间生态位随着温度的降低而变窄的趋势。

3结论与讨论

随着温度的升高,拟环纹豹蛛头胸部Ca2+含量随之升高,这可能是随饲养温度的增加,其新陈代谢增强的缘故。Ca2+信号通过激活多种Ca2+依赖的蛋白激酶、磷酸酶、蛋白酶,发挥Ca2+信号的级联放大作用,导致神经冲动传递速度加快,范围加广,蜘蛛新陈代谢加强,肌肉的兴奋性和肌纤维的活动力增强,导致蜘蛛的兴奋性加强。而随着饲养温度的升高,蜘蛛头胸部Mg2+含量却逐渐减小,Mg2+与去氢酶的结合率高低影响冬眠和冬眠消素的分泌,当蜘蛛长时间处于5 ℃或更低温度时,蜘蛛将转入冬眠状态。随温度的升高,蜘蛛体内Mg2+与去氢酶结合率升高,加上作为细胞内第二信使的Ca2+运载信息电流,激活体内代谢变化,可能导致Mg2+含量随温度的升高而递减。

拟环纹豹蛛AChE主要集中在头胸部,这与其他许多害虫的AChE的分布类似。AChE的活性越高,对乙酰胆碱的分解越强,那么蜘蛛的兴奋性就越弱,反之亦然。

空间生态位是生态学研究的重要内容,一般空间生态位宽度值可以反映蜘蛛的分布范围和活动强度。随着温度的升高,拟环豹纹蛛的空间生态位变宽,冬眠期的潜伏不动到夏季高温的活动频繁,显示了拟环豹纹蛛体内生物活动性的增强,即一定程度上反映了作为神经递质的钙离子对拟环纹豹蛛的活动性产生了影响。

4参考文献

[1] 王智,付秀芹,宋大祥. 田间施药对拟环纹豹蛛羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶分布及活性的影响[J]. 昆虫学报,2006,49(2):260-264.

[2] 王瑞婷,郝希俊,李宝群,等.钙通道及细胞内钙释放机制[J].承德医学院学报,2000,17(4):166-169.

[3] 李洞.钙代谢影响因素研究[J].国外医学:医学地理分册,1998,19(3):101-114.

[4] 王水锋,郭敬华,陈汉晓,等.ICP-AES法测定面制食品中的多元素[J].中国现代教育装备,2007(10):21-22.

[5] 张胜帮,张学俊,郭玉生.微波消解电感耦合等离子体发射光谱法测定葛根中钾元素的研究[J].温州师范学院学报:自然科学版,2001,22(6):38-40.

[6] 蒋传葵,金承德,吴仁龙,等.工具酶的活力测定[M].上海:上海科学技术出版杜,1982:55-56.

[7] 朱灵峰.无机及分析化学[M].北京:中国农业出版社,2004:142-146.

[8] 叶非.有机化学[M].北京:中国农业出版社,2004:104-120.

[9] 林春竹,谢镇远,孙咏梅.微量进样-火焰原子吸收光谱法测定豚鼠内耳外淋巴液中钙、镁、钾、钠等元素含量[J].广东微量元素科学,1997,4(12):48-51.

[10] 王智,曾伯平,李文健,等.稻田蜘蛛优势种和目标害虫的时间生态位研究[J].湖南农业科学,2002,28(2):57-59.