含多酶切位点融合黄色荧光蛋白的植物通用载体的构建与应用

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摘要：以植物表达载体pCAMBIA3301为基本骨架，以黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein，简称YFP）为标签蛋白构建可融合目标蛋白的表达载体，并包含可用于外源基因插入的单一识别位点的核酸酶酶切位点（Spe Ⅰ、Xba Ⅰ、Sma Ⅰ、BamH Ⅰ）。为了验证载体的实用性，将构建完成的载体转化到感受态GV3101农杆菌上，进行菌落PCR鉴定，再分别瞬时转化烟草下表皮和稳定转化拟南芥。激光共聚焦显微镜观察结果显示，在阳性转基因植株上均观察到荧光，在阴性对照上没有观察到荧光，表明YFP标签蛋白在转基因受体细胞中能够正常表达。pCAMBIA3301：：YFP载体的成功构建为植物蛋白亚细胞定位及过表达转基因植株等相关领域的研究提供了稳定可靠的通用型载体资源。

关键词：多酶切位点;黄色荧光蛋白;通用载体;激光共聚焦;植物基因表征工具

中图分类号： S188  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）16-0056-07

收稿日期：2018-04-04

基金项目：湖北省自然科学基金（编号：2015CFB348）;国家“863”计划（编号：2013AA102602）。

作者简介：匡 琛（1994—），男，湖南益阳人，硕士研究生，研究方向为功能基因组学与蛋白质组学。

通信作者：华 玮，博士，研究员，主要从事油菜功能基因组学研究。

植物表达载体是高等植物基因功能研究中不可或缺的工具，在后基因组时代具有广泛的应用[1]。植物表达载体可以用来研究启动子元件、蛋白质互作、亚细胞定位以及组成型表达。植物双元表达载体的发展和不同农杆菌菌株的选育，使得农杆菌介导的植物转化系统得到广泛应用[2]。早期的植物双元表达载体主要是由复制起始位点、2个T-DNA边界重复序列之间的部分、大肠杆菌筛选标记、目的基因与启动子元件及植物筛选标记组成的。植物表达载体的构建方法有传统的酶切连接法[3]和T-DNA插入法[4]。随着现代生物技术的发展，出现了多种新的技术，如Gateway法[5]、不依赖于基因序列和连接反应的不依赖序列和连接的克隆方法（sequence and ligation independent cloning，简称SLIC）[6]、重组融合PCR技术[7]、一步克隆法[8]、基于竞争性连接原理构建小片段基因表达载体技术[9]、无缝连接克隆In-Fusion技术[10]和快速克隆Golden Gate拼接法等[11]。综合比较上述几种载体构建的生物技术，基于SLIC原理的一步克隆方法具有操作简单、效率高、经济实惠及适用范围广等优点，被广泛应用到植物表达载体的构建中。

pCAMBIA系列双元表达载体是进行植物遗传转化最常用的表达载体之一，大多数植物功能基因组学研究所用的表达载体都以之为骨架[12-13]。植物表达骨架载体pCAMBIA3301所使用的报告基因是细菌的β-葡萄糖苷酸酶基因（β-glucuronidase，简称GUS）。虽然GUS蛋白相对较易检测，但是检测底物成本高，染色过程会损伤细胞的超微结构，从而对细胞造成一定毒害，并且反应中间物的扩散会影响葡萄糖苷酶本身在细胞内的准确定位[14]。基于GUS蛋白检测的局限性，目前发展了荧光蛋白标记技术[14]。与GUS蛋白相比，荧光蛋白的检测具有以下优点：（1）操作简单，在鉴定转基因植株时，只需取样制作临时切片，使用荧光显微镜观察有无荧光，省去了前处理等试验;（2）可以使用活体生物发光荧光成像系统进行活体检测;（3）对转基因植株的损伤较小，目前最常用的荧光蛋白是绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，简称GFP），它是从维多利亚水母中分离纯化出的一种可以发出绿色荧光的蛋白[15]。GFP生色基团的形成无种属特异性，GFP蛋白对细胞没有毒害作用，不会影响细胞的正常生长和功能[15]。以GFP作为选择标记基因，可以很方便地从大量细胞或组织中筛选出转化细胞和植株，并可追踪外源基因的分离或亚细胞定位。Sleight等利用Gibson法成功构建了Cyan-Megenta-Yellow表达载体，并插入启动子、终止子和核糖体结合位点等元件，从而编码青色荧光蛋白（CFP）、红色荧光蛋白（RFP）、黄色荧光蛋白（YFP）共3种荧光蛋白[16]。YFP是GFP的突變体，与GFP相比，YFP蛋白的荧光向红色光谱偏移。GFP的最大激发波长为395 nm，最大发射波长为509 nm，而YFP的最大激发波长为514 nm，最大发射波长为527 nm[17-18]。GFP在非模式植物如油菜中的表达不稳定，荧光强度弱，较难观察到荧光[19-20]。通过基因工程遗传转化引入YFP蛋白，较易观察到稳定的荧光，这可能是由于YFP存在更大的发射波长与激发波长。因此，在非模式植物的遗传转化中，YFP蛋白更具优势[20-21]。

基于SLIC技术的原理，可将插入片段PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点，称为一步克隆法，此技术的关键在于设计带有一步克隆酶切位点接头的引物序列，即在插入片段PCR引物的5′端引入线性化克隆载体末端序列，从而使插入片段PCR产物的5′端和3′端分别带有与载体2个末端对应的一致序列（15 bp左右）。本研究利用pCAMBIA3301：：GFP（为笔者所在实验室用pCambia3301、pAN580载体改造而来）作为基础载体。本研究用此方法构建了用于非模式植物的多酶切位点遗传转化通用载体pCAMBIA3301：：YFP。该载体在T-DNA右边界具有8个酶切位点，其中4个酶切位点（Spe Ⅰ、Xba Ⅰ、Sma Ⅰ和BamH Ⅰ）可用于插入目的基因，在T-DNA左边界具有10个可供选择的酶切位点，并且在CaMV 35S启动子的两端均有多克隆酶切位点，可以根据需要对启动子进行替换。本研究构建的多酶切位点融合黄色荧光蛋白通用载体，为研究植物基因功能提供了一种有力工具。