黄沙鳖抗菌肽cathelicidin基因克隆及表达特征分析

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摘要：【目的】克隆黄沙鳖cathelicidin基因并分析其组织分布特征及在攻毒后的表达变化，为深入研究cathelicidin功能及在黄沙鳖先天免疫中的潜在作用提供基础数据。【方法】采用RT-PCR结合RACE克隆黄沙鳖cathelicidin基因cDNA全长序列，利用生物信息学分析软件对黄沙鳖cathelicidin基因及其推导氨基酸序列进行结构特征分析，并采用实时荧光定量PCR检测黄沙鳖cathelicidin基因在不同组织中的表达特征及攻毒后的表达变化。【结果】黄沙鳖cathelicidin基因cDNA序列全长1026 bp（GenBank登录号MK250818），包括483 bp的开放阅读框（ORF）、315 bp的5"非编码区（5"UTR）和228 bp的3"非编码区（3"UTR）。黄沙鳖cathelicidin基因cDNA序列编码160个氨基酸，包括氨基端的信號肽区域、含有4个保守半胱氨酸（Cys）残基的cathelin区域及羧基端的成熟肽区域。黄沙鳖cathelicidin基因推导氨基酸序列与中华鳖cathelicidin基因推导氨基酸序列（KY948708.1）的相似性最高，为97.5%;基于cathelicidin基因推导氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示黄沙鳖与中华鳖的亲缘关系最近。黄沙鳖cathelicidin基因在脾脏和肝脏中的相对表达量相对较高，其次是心脏，在脑组织、肾脏、肠道、肌肉、表皮和背甲的相对表达量较低。以温和气单胞菌攻毒后，黄沙鳖脾脏cathelicidin基因相对表达量呈升—降—升—降的波动变化趋势，出现2个峰值（攻毒后第3和36 h），对应的cathelicidin基因相对表达量分别是对照（注射等量无菌生理盐水）的23.1和3.5倍。【结论】黄沙鳖cathelicidin基因在脾脏和肝脏中高表达量，且可被温和气单胞菌感染诱导，说明cathelicidin基因在黄沙鳖抵抗病原感染过程中发挥重要作用。

关键词： 黄沙鳖;抗菌肽;cathelicidin;基因克隆;表达特征

0 引言

【研究意义】黄沙鳖（Pelodiscus sinensis）为中华鳖（P. sinensis）的地理种群（黄雪贞等，2012;农新闻等，2015），主要分布于我国两广的西江流域，为广西名优养殖品种之一，其养殖业也是广西水产养殖的重要支柱产业之一（张秋明等，2010）。黄沙鳖味鲜肉嫩、营养丰富，其裙边富含易被人体吸收的小分子胶原蛋白，单位质量的肌肉粗蛋白含量和必需氨基酸指数均高于中华鳖（赖春华等，2011;周吴萍等，2012），深受广大消费者喜爱。但近年来由于各种病害的暴发流行，导致黄沙鳖养殖损失惨重（农新闻等，2015）。Cathelicidins是一类由氨基端信号肽、中间cathelin结构域和羧基端成熟肽构成的宿主抗菌肽（张东玲和喻达辉，2015），广泛分布于各种脊椎动物体内，是宿主防御病毒和细菌等病原入侵的重要屏障，为脊椎动物先天免疫的关键组成部分。因此，加强对黄沙鳖cathelicidin基因的研究，有助于进一步认识黄沙鳖的先天免疫系统。【前人研究进展】cathelicidin于20世纪90年代最先在猪中被发现，后来陆续有研究证实该抗菌肽在其他哺乳类、鸟类、鱼类、两栖类和爬行类等脊椎动物中也广泛存在（Lehrer and Ganz，2002;Zanetti，2005）。cathelicidin在动物体中通常以无活性前体肽的形式存在，需经蛋白酶水解才能释放出具有活性的成熟肽（广慧娟，2013）。cathelicidin成熟肽能与带负电荷的细菌磷脂细胞膜相互作用，从而破坏细菌的细胞膜以达到抑菌效果，具有较强的广谱抗菌活性，且不易产生耐药性（Saleem et al.，2010;Tajbakhsh et al.，2018）。于海宁等（2014，2015）研究表明，采用化学方法合成的中华鳖cathelicidin成熟肽Ps-CATH4具有很强的抗菌活性，不易产生耐药性，细胞毒性低，且具有抑制炎症细胞因子释放等作用。cathelicidin除了具有抗微生物活性外，还参与宿主的抗炎症、结合内毒素、趋化作用、抑制组织损伤、促血管生成及伤口修复等各种防御性生理进程中（王晨等，2017;Chen et al.，2018）。例如猪cathelicidin PR-39可减轻由自由基引起的组织损伤，具有促血管生成及促创伤愈合等功能作用（Zanetti，2005）;人源cathelicidin LL-37除了能诱导单核细胞和中性粒细胞等白细胞发生趋化运动外，还可调节先天性免疫和获得性免疫等（Chen et al.，2018）。【本研究切入点】目前，已有关于中华鳖cathelicidin基因序列的研究报道（于海宁等，2014），但针对黄沙鳖cathelicidin基因克隆及相关表达特征至今未见报道。【拟解决的关键问题】克隆黄沙鳖cathelicidin基因并采用实时荧光定量PCR检测其组织分布特征及在攻毒后的表达变化，为深入研究cathelicidin功能及在黄沙鳖先天免疫的潜在作用提供基础数据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

健康黄沙鳖购自广西武宣县某养鳖场，个体均重约45 g。经20 d的检疫饲养观察，确定无异常后用于细菌攻毒试验。攻毒试验采用的温和气单胞菌（Aeromonas sobria）WMG2菌株为广西水生动物病害诊断实验室于2015年分离自南宁市武鸣区患病黄沙鳖，攻毒试验前先进行生化鉴定和分子鉴定确认。TRIzol试剂购自Introvigen公司;TIANgel Midi Purification Kit试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司;MgC12、dNTPs、Taq DNA聚合酶、10×PCR缓冲液、DL1000 DNA Marker、pMD18-T载体Cloning Kit试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒、SYBR Premix Ex Taq试剂盒和SMARTer RACE 5"/3" Kit试剂盒均购自TaKaRa公司;普通营养琼脂培养基购自北京陆桥技术股份有限公司。