prd29A—otsAB表达载体的构建与转化本生烟草的研究

摘要：分别以拟南芥（Arabidopsis thaliana）和大肠杆菌（Escherichia coli）的基因组DNA为模板，通过PCR技术克隆得到rd29A启动子、otsA和otsB基因，将其依次插入到p2300-gfp质粒中，从而构建p2300-prd29A-otsAB融合基因表达载体。利用农杆菌介导法将prd29A-otsAB融合基因导入到本生烟草（Nicotiana benthamiana）中，通过对转基因烟草进行筛选，初步获得具有卡那霉素抗性的转基因植株，为今后进一步研究相关基因的功能以及通过基因工程技术提高植物的抗胁迫能力奠定基础。

关键词：海藻糖；prd29A；otsA基因；otsB基因；本生烟草（Nicotiana benthamiana）；农杆菌

中图分类号：Q943.2；S572 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）11-2148-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.11.039

Abstract： The rd29A promoter of Arabidopsis thaliana，otsA and otsB genes in Escherichia coli were cloned by PCR respectively. Afterwards，the target fragments were ligated into plasmid p2300-gfp，which would lead to the construction of p2300-prd29A-otsAB expression vector. By Agrobacterium-mediated method，the prd29A-otsAB fusion gene was introduced into Nicotiana benthamiana，and then the transgenic Nicotiana benthamiana was obtained through the tissue culture and antibiotics screening for the first time. The experimental results can provide the reference for improving the stress resistance of plants through genetic engineering.

Key words： trehalose；rd29A promoter；otsA gene；otsB gene；Nicotiana benthamiana；Agrobacterium

土壤盐碱化是制约农作物生长及产量提高的重要因素，土壤中盐分过高，会引起植物出现渗透胁迫、离子毒害、营养元素亏缺等症状，正常的生长发育受阻[1]。植物可通过在细胞中积累某些渗透保护剂维持对水分的吸收，消除盐胁迫所造成的伤害[2]。海藻糖为其中一类重要的渗透保护剂，由2个葡萄糖分子缩合而成[3]。目前发现至少有5种不同的海藻糖合成途径，其中最为典型的是TPS/TPP途径[4，5]。在该途径中，6-磷酸海藻糖合成酶（TPS）催化尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖合成6-磷酸海藻糖，然后在6-磷酸海藻糖磷酸化酶（TPP）的作用下发生去磷酸化生成海藻糖[6]。已有研究表明，转入海藻糖合成相关基因，可以改善植物对逆境的抵御能力。将酵母TPS基因导入马铃薯、玉米和水稻中，植物抵御干旱和盐胁迫的能力明显提高[7-9]。大肠杆菌otsA和otsB基因分别编码TPS和TPP，otsAB融合基因的表达极大地提高了水稻对非生物胁迫的耐受能力[10]。过量表达AtTPS1基因，拟南芥耐旱性也得到了提高[11]。OsTPS1过表达显著增强了水稻抗低温、高盐和干旱等逆境胁迫的能力[12]。海藻糖与植物的抗逆性密切相关，但其在植物体内含量极低[10]。因此，如何有效地提高植物体内海藻糖的含量，进而增强植物的抗逆能力，已成为当前研究的重要课题之一。

本生烟草（Nicotiana benthamiana）为重要的模式植物，但有关海藻糖在其体内合成方面的研究鲜见报道。本试验通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的叶盘法将prd29A-otsAB表达载体导入到本生烟草中，以期有效提高转基因植株中海藻糖的含量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 本生烟草和拟南芥（Arabidopsis thaliana）种子，由山东省黄河三角洲野生植物资源开发利用工程技术研究中心提供。大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α和根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101由滨州学院生命科学系基因工程实验室保存，p2300-gfp质粒由兰州大学细胞研究所提供。

1.1.2 试剂 限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、高保真PCR扩增试劑盒为TaKaRa公司产品，DNA Marker 3、pTZ57R/T载体为兰州鹏程生物技术有限公司产品，Taq酶、质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒为Fermentas公司产品。

1.1.3 培养基 共培养培养基：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。筛选培养基：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+Carb（Carbenicillin）+Kan （Kanamycin）。增殖培养基：MS+Carb+Kan。生根培养基：MS+0.1 mg/L NAA+Carb+Kan[2]。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆 根据GenBank数据库中拟南芥rd29A启动子（prd29A）、大肠杆菌otsA和otsB基因序列的相关信息进行引物设计。引物序列（下划线代表酶切位点的位置）如下：prd29A-F（5′CGCAAGCTTAGATTTGGGGTTTTGCTTTTGAATG3′）（HindⅢ）、prd29A-R（5′GCGGAGCTCTTTCCAAAGATTTTTTTCTTTCCAA3′）（SacⅠ）、otsA-F（5′GAG CTCTAGAATGAGTCGTTTAGTCGTAGT3′） （XbaⅠ）、otsA-R（5′ATAGTCGACCGCAAGCTTTGGAAAGGTAG3′）（SalⅠ）、otsB-F（5′ATAGAGCTCATGACAGAACCGTTAACCGAAACC3′）（SacⅠ），otsB-R（5′GCGTCTAGAGATACTACGACTAAACGACTCATAGT 3′）（XbaⅠ）。分别以拟南芥和大肠杆菌基因组DNA为模板，高保真PCR扩增相应的目的片段。

1.2.2 植物表达载体的构建 将prd29A、otsA和otsB分别插入pTZ57R/T，构建pTZ57R/T-prd29A、pTZ57R/T-otsA和pTZ57R/T-otsB克隆载体。用限制性核酸内切酶HindⅢ-SacⅠ酶切质粒p2300-gfp和pTZ57R/T-prd29A，连接回收目的片段，构建p2300-prd29A-gfp表达载体。用SacⅠ-XbaⅠ酶切连接pTZ57R/T-otsB和p2300-prd29A-gfp，构建p2300-prd29A-otsB表达载体。用XbaⅠ-SalⅠ酶切pTZ57R/T-otsA和p2300-prd29A-otsB，实现p2300-prd29A-otsAB融合基因表达载体的构建（图1）。

1.2.3 抗生素敏感性试验 将本生烟草叶片分别接种到含0、10、20、30、40、50、60和100 mg/L卡那霉素的不定芽诱导培养基中，30 d后根据外植体的分化情况，确定转基因植株合适的筛选浓度。在农杆菌生长培养基和本生烟草不定芽诱导培养基中分别添加羧苄青霉素（Carb），将Carb的浓度设为0、100、200、300、400、500、600和1 000 mg/L共8个水平，分别接种含p2300-prd29A-otsAB重组质粒的农杆菌和本生烟草叶片，观察农杆菌和外植体的生长状态和存活情况，确定转基因植株筛选过程中去除农杆菌合适的Carb浓度。

1.2.4 本生烟草的遗传转化 将含重组质粒的农杆菌进行振荡培养，测其OD600 nm约为0.5时进行离心，加入等量的MS基本培养基悬浮菌体；以本生烟草的叶片作为外植体，置于菌液中侵染3～5 min；吸干后接种到共培养培养基，2 d后将叶片转入筛选培养基中诱导抗性芽，并在增殖培养基中对抗性芽进行增殖培养；切取合适大小的不定芽，在生根培养基中诱导抗性芽生根。

2 结果与分析

2.1 p2300-prd29A-otsAB融合基因表达载体的构建

分别以野生型拟南芥和大肠杆菌基因组DNA为模板，高保真PCR扩增拟南芥prd29A、大肠杆菌otsA和otsB（图2A）。回收PCR扩增产物，连入pTZ57R/T载体。分别酶切p2300-gfp和pTZ57R/T-prd29A，连接后转入大肠杆菌。通过PCR和酶切技术对重组质粒进行鉴定，结果显示prd29A已连入p2300-gfp，从而实现p2300-prd29A-gfp表达载体的构建（图2B）。分别酶切pTZ57R/T-otsB和p2300-prd29A-gfp，将回收的目的片段进行连接，鉴定重组体，表明otsB基因已插入p2300-prd29A-gfp，从而实现p2300-prd29A-otsB表达载体的构建（图2C）。分别酶切pTZ57R/T-otsA和p2300-prd29A-otsB，回收、连接目的片段，鉴定结果表明otsA基因已插入p2300-prd29A-otsB，从而实现p2300-prd29A-otsAB融合基因表达载体的构建（图2D）。

2.2 抗生素对本生烟草不定芽诱导和农杆菌生长的影响

将本生烟草叶片接种到含不同浓度Kan的不定芽诱导培养基中。30 d后在不含Kan的对照培养基上，外植体产生大量的不定芽（图3A）；而添加Kan的培养基中，多数叶片变黄，难以分化（图3B-H）。当Kan浓度为10～20 mg/L时，少数叶片产生少量绿色的芽点；当Kan浓度为30～40 mg/L时，仅有极少量细胞存活，绝大多数叶片已完全枯萎；当Kan浓度大于50 mg/L时，叶片完全白化死亡。因此，50 mg/L可作为临界浓度筛选转化细胞。Carb能有效抑制农杆菌的生长，当农杆菌p2300-prd29A-otsAB接种于Carb浓度大于100 mg/L的培养基时，农杆菌的生长几乎完全受到抑制，而对照则可正常生长（图3I、J），表明農杆菌p2300-prd29A-otsAB对Carb极其敏感，极少量的Carb也能有效抑制根癌农杆菌的生长。用不同浓度的Carb处理本生烟草的叶片，当Carb浓度100～500 mg/L时，外植体不定芽诱导效果明显优于对照（图3K-P）；当Carb浓度达到600 mg/L时，抗性芽的分化受到抑制（图3Q）；而当Carb浓度为1 000 mg/L时，外植体严重白化，抗性芽的分化率明显降低（图3R）。因此，Carb抑制农杆菌生长的最佳使用浓度为500 mg/L。

2.3 prd29A-otsAB融合基因转化本生烟草

活化含prd29A-otsAB融合基因的农杆菌，叶盘法转化本生烟草。将共培养2 d的外植体接种到含50 mg/L Kan和500 mg/L Carb的筛选培养基中进行抗性诱导。15 d后叶片上产生大量绿色的芽点，其中部分芽点已形成不定芽（图4A）。21 d后多数芽点已生长为成簇分布的抗性芽（图4B）。随着培养时间的延长，抗性芽不断分化，生长旺盛（图4C-F）。将培养30 d的叶片转移至含50 mg/L Kan和250 mg/L Carb增殖培养基中继续培养14 d，可获得大量生长状态良好的不定芽（图4G、H）。切取不定芽，接种于添加50 mg/L Kan和250 mg/L Carb生根培养基中诱导生根（图4I）。约30 d后，不定芽开始生根成苗。8周后抗性芽基部产生大量的根，试管苗生长健壮（图4J、K）。当根布满瓶底，幼苗高度约8～10 cm时，便可进行抗性苗的驯化移栽（图4L）。

3 小结与讨论

为了有效提高植物体内海藻糖的含量，本试验成功克隆了拟南芥rd29A启动子、大肠杆菌otsA和otsB基因并构建了prd29A-otsAB融合基因表达载体。利用根癌农杆菌介导的叶盘法将其导入到受体细胞中。海藻糖是非还原性双糖，广泛存在于生物体内，它不仅能为生物体的新陈代谢提供和储存能量，而且在非生物胁迫条件下，海藻糖可以保护生物体组织和大分子的功能和活性[6]。植物在遭受逆境胁迫时，海藻糖含量提高，进而增强植物对不良环境的耐受性[13]。海藻糖提高植物抗逆性的分子机制尚不清楚。已有研究表明，在植物体内，TPS和TPP催化海藻糖的生物合成[5，6]。海藻糖合成相关基因在植物生长发育、逆境调控中具有重要作用，通过转入海藻糖合成相关基因可以改善植物对逆境的抵御能力。将酵母TPS1基因导入玉米中，可以促进玉米根系生长，提高脯氨酸与叶绿素含量，增强玉米的抗旱能力[8，9]。坛紫菜PhTPS基因在中高水平失水条件下，其表达水平可显著上调[14]。转大肠杆菌otsA基因的本生烟草幼苗在含有150 mmol/L NaCl的培养基中生长效果明显优于对照[15]。

与传统的抗逆育种工作相比，基因工程育种以其特有的优势，受到越来越多的关注。现阶段，海藻糖合成相关基因不断被克隆并导入相应的受体细胞中，但海藻糖的合成效果仍不理想，植物的抗逆效果有待于进一步提高。外源基因在受体植物中的表达受多种因素的影响，其中启动子在决定基因表达方面起重要作用。rd29A启动子属于逆境诱导型启动子，植物只有在受到干旱、高盐、低温等胁迫时，该启动子才驱动目的基因表达[16]。

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