O型口蹄疫病毒VP1基因及其多表位基因的原核表达与纯化鉴定

摘要：【目的】通过原核表达并纯化获得O型口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因及其多表位基因的重组蛋白，为建立O型FMDV抗体ELISA检测试剂盒及制备动物高免血清提供技术支持。【方法】以O型FMDV VP1全基因重组质粒pMD18-T-T-VP1及串联的VP1多表位基因重组质粒pMD18-T-O-VP1为模板，通过特异性引物扩增并回收目的基因，构建重组质粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1，然后转入大肠杆菌BL211（DE3）中诱导表达，并以SDS-PAGE和Western blotting对融合蛋白进行分析鉴定。【结果】O型FMDV的VP1基因及其多表位基因在大肠杆菌BL21（DE3）中得到正确表达，表达的两种融合蛋白主要以包涵体形式存在，纯度较高，且均能与猪抗O型FMDV阳性血清发生特异性结合，具有良好的反应原性。【结论】表达获得的融合蛋白具有良好的反应原性，可作为包被抗原应用于O型FMDV抗体检测试剂盒研发。

关键词： O型FMDV；VP1基因；多表位基因；原核表达；纯化；鉴定

中图分类号： S852.659.6 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）03-0472-06

0 引言

【研究意义】口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）已被列为A类动物传染病，是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）引起的一种高度接触性传染病（Sobrino et al.，2001；颜健华等，2015）。FMDV可感染多种偶蹄动物，传播迅速，感染率高，一旦暴发将造成重大的经济损失，许多国家高度重视对该病的研究。自2010年起，我国及周边国家相继发生O型FMD疫情（何继军等，2015），且与A型、Asia1型呈交替流行趋势，涉及面广、破坏性强（刘畅等，2013）。因此，加强FMD疫情监测及预警预报，对有效防控FMD及促进我国畜牧业健康发展具有重要意义。【前人研究进展】组成FMDV衣壳的主要结构蛋白有4种，分别为VP1、VP2、VP3和VP4（Collen et al.，1991）。FMDV的抗原区域主要位于结构蛋白VP1的第141～160位和第200～213位氨基酸残基，可诱导动物机体产生中和抗体，同时也是抗原性的高变区（Mateu et al.，1996；柳纪省，1999）。因此，研究分析FMDV主要抗原区域的高变区不仅对揭示病毒遗传变异机理具有重要意义，还能为FMD流行病学研究及新型疫苗研制提供参考依據。目前，我国已有研究以VP1蛋白的第21～40位及第141～160位基因片段与β-半乳糖甘基因构建重组表达载体（杨志军等，2000），或将猪重链恒定区作为抗原载体的DNA疫苗（李金光等，2001），经相关动物试验证实免疫效果良好。梁特等（2013）、解银丽等（2015）采用杆状病毒表达系统成功构建并表达了O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒，为O型FMDV疫苗的研究奠定了基础。特尼格尔等（2015）研制的多型FMDV VP1表位融合蛋白与O型、A型和Asia1型FMDV阳性血清均能特异性结合，为VP1表位肽的免疫原性研究提供了参考。【本研究切入点】鉴于O型FMDV近年来的流行趋势及FMDV抗原结构的复杂性，且不同血清型、基因型和分离株间的抗原位点及抗原表位均存在差别，因此有必要针对O型FMDV的VP1基因及其主要的抗原表位进行深入研究，为今后有效防控O型FMD提供参考。【拟解决的关键问题】采用原核表达系统对O型FMDV VP1基因及串联的VP1多表位基因进行表达，对表达所得的两种目的蛋白进行鉴定，分析其特异性及反应原性，以期为建立针对O型FMDV的竞争ELISA检测方法及制备动物高免血清提供技术支持。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

O型FMDV VP1全基因重组质粒pMD18-T-T-VP1及串联的VP1多表位基因重组质粒pMD18-T-O-VP1由广西动物疫病预防控制中心家畜疫病诊断实验室保存提供；DL2000 DNA Marker、氨苄青霉素（Amp）贮存液、大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞、小量质粒提取试剂盒等购自天跟生化科技（北京）有限公司；EcoR I和Xho I限制性内切酶、胶回收试剂盒、T4 DNA连接酶、IPTG等购自宝生物工程（大连）有限公司；猪抗O型FMDV阳性血清购自中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗豚鼠IgG抗体、低分子量蛋白质Marker购自北京博奥森生物技术有限公司。

1. 2 引物设计与合成

根据原核表达载体（pET-32a和pGEX-6p-1）的酶切位点、FMDV VP1基因开放阅读框及其串联后VP1多表位基因，运用Oligo 6.0软件设计2对表达引物（表1）。每条上游引物的5"端均添加EcoR I酶切位点（下划线部分），下游引物的5"端均添加Xho I酶切位点（下划线部分）。引物均由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1. 3 原核重组表达载体构建

以重组质粒pMD18-T-T-VP1和pMD18-T-O-VP1为模板，用特异性引物VP1/VP2、O1/O2扩增并回收目的基因。采用EcoR I和Xho I进行双酶切，并用同样的酶切处理原核表达载体pET-32a和pGEX-6p-1，分别将扩增获得的目的基因酶切回收产物与表达载体的酶切回收产物进行连接，然后转化BL21（DE3）感受态细胞，提取重组质粒后，对阳性重组质粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1进行鉴定。

1. 4 诱导表达重组菌

对阳性重组质粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1的菌液进行复苏，于37 ℃下摇床（180 r/min）过夜培养。将复苏菌液加入到含Amp的LB培养液中，37 ℃下斜摇（200 r/min）培养，待菌液OD值达0.4～0.6时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导表达，分别在重组菌诱导前和诱导后1、2、3、4和5 h取样，离心收集菌体后，通过SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况，再采用扫描的方法分析重组蛋白在菌体中的具体含量。

1. 5 重组表达菌表达形式确定

在最佳诱导表达条件下，取诱导表达后的菌液50 mL，10000×g离心10 min，弃上清液；用PBS洗涤重组菌沉淀，重复洗涤3次；加入30 mL PBS重悬重组菌沉淀，反复冻融3次后，在冰浴中超声波裂解40 min；离心后分别收集裂解的沉淀和上清液，通过SDS-PAGE分析表达目的蛋白的表达形式。

1. 6 重组蛋白纯化

重组蛋白pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1均采用柱层析纯化方法进行纯化，其纯化步骤按照试剂盒说明进行操作，然后采用SDS-PAGE分析两个重组蛋白的纯化效果。

1. 7 Western blotting鉴定

将已纯化好的重组蛋白PET-32a-VP1和pGEX- 6P-1-VP1进行SDS-PAGE分析，目的蛋白通过蛋白转膜仪转移到硝酸纤维素（NC）膜上，然后参照汪家政和范明（2000）的方法进行Western blotting鉴定。

2 结果与分析

2. 1 原核重组表达载体

采用特异性表达引物VP1/VP2扩增得到完整的VP1基因，大小为639 bp（图1）；采用特异性表达引物O1/O2扩增得到含VP1主要抗原位点基因片段，大小为384 bp（图2），两个目的片段均与预期结果一致。将两个目的片段分别克隆至原核表达载体pET-32a和pGEX-6p-1，经PCR和双酶切鉴定，结果显示重组质粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1的目的片段与预期结果一致（图3和图4）。

2. 2 重组菌的融合表达及SDS-PAGE分析结果

重组菌pET-32a-VP1/BL21和pGEX-6p-1-VP1/BL21分别于诱导前和诱导后1、2、3、4和5 h取样， SDS-PAGE分析结果显示，重组菌pET-32a-VP1/BL21经IPTG诱导5 h后其目的蛋白表达量达到峰值，在相对分子量44.0 kD处有一条明显增量的蛋白条带（图5），与预期结果相符；重组菌pGEX-6P-1-VP1/BL21经IPTG诱导4 h后其目的蛋白表达量达到峰值，在相对分子量42.0 kD处出现一条明显增量的蛋白条带（图6），与预期结果相符；而未经诱导的菌液无任何表达蛋白条带出现。

2. 3 融合表达产物的可溶性分析结果

以1 mmol/L IPTG诱导3 h的重组菌pET-32a- VP1/BL21和pGEX-6p-1-VP1/BL21经超聲波裂解后，收集超声波裂解菌液离心所得上清液和沉淀进行SDS-PAGE分析，结果显示，两种融合蛋白在菌体中主要以包涵体的形式存在（图7）。

2. 4 融合蛋白的纯化结果

蛋白包涵体经层析柱纯化复性后，得到的融合蛋白进行SDS-PAGE分析鉴定，结果发现融合蛋白条带大小与预期结果一致，且条带较清晰、单一（图8），说明融合蛋白纯化效果较好。

2. 5 融合蛋白的Western blotting鉴定结果

对纯化复性的融合蛋白pET-32a-VP1和pGEX- 6p-1-VP1进行Western blotting鉴定，结果显示在预期目的处出现特异性反应条带（图9和图10），说明诱导表达获得的融合蛋白均能与猪抗O型FMDV阳性血清发生特异性结合，即具有免疫学活性。

3 讨论

FMDV的VP1基因由639个核苷酸组成，共编码213个氨基酸，是病毒结构中最重要的抗原位点及抗原变异的关键域区（Mateu et al.，1996；柳纪省，1999），可诱导动物机体产生中和抗体。VP1蛋白的第21～40位氨基酸肽段是重要的T细胞抗原蛋白（Collen et al.， 1991）；第141～160位、第200～213位氨基酸肽段能够保护动物抵抗病毒攻击，是重要的B细胞抗原表位（Bittle et al.，1983）；第40～60位氨基酸肽段具有调节第141～160位、第200～213位氨基酸抗原表位的功能，也是重要的B细胞抗原表位（Parry et al.，1990）。本研究选用的VP1多表位基因是由第21～60位、第141～160位及第200～213位氨基酸肽段串联构成，既含T细胞表位，又含B细胞表位。邵军军和常惠芸（2008）研究发现，可通过增加抗原表位、引入外源载体蛋白或T细胞表位等方法提高表位肽的免疫原性；在特异性免疫应答中，T细胞表位发挥重要作用，且部分B细胞表位也需要与T细胞表位相互作用才能诱导动物机体内产生抗体。因此，本研究选择VP1全长基因及VP1多表位基因作为表达的目的基因，以期鉴定两种目的基因表达所得融合蛋白的反应原性及特异性，并比较两者间的差异，为下一步建立ELISA选择合适的包被抗原及研制FMDV重组蛋白亚单位疫苗提供参考。

本研究诱导表达获得的融合蛋白主要以包涵体形式存在。包涵体是由于融合蛋白在其自身的表达过程中对环境不适应，导致不能形成正确的次级键或缺乏依稀蛋白质折叠的辅助因子等原因所形成（夏启玉等，2007）。以包涵体形式存在的重组蛋白具有以下优点（罗莉等，2012）：（1）杂蛋白在包涵体中的含量较低，采用离心方法即可达到与可溶性蛋白分离的目的，便于分离纯化；（2）可避免菌体蛋白酶对外源蛋白的降解；（3）降低了胞内外源蛋白浓度，利于目的蛋白表达量的提高；（4）包涵体对机械搅拌和超声波破碎均不敏感，易与细胞膜碎片进行分离。但以包涵体形式存在的重组蛋白是需要经过变性剂溶解，再进行复性才能得到溶解的蛋白质。

本研究选取pET-32a和pGEX-6P-1为原核表达载体，其目的是为了避免载体自身表达蛋白与抗原蛋白产生非特异性结合，而产生假阳性对研究结果造成影响。大肠杆菌BL21（DE3）菌株是以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因蛋白表达宿主，尤其适合于非毒性蛋白的表达。本研究选取大肠杆菌BL21（DE3）作为宿主菌表达FMDV的主要结构蛋白VP1及其主要抗原位点的基因蛋白，经SDS-PAGE分析和Werstern blotting鉴定，结果显示，融合蛋白均得到正确表达。此外，选用大肠杆菌表达VP1多表位基因的蛋白作为包被抗原，可去除无关基因的干扰，提高包被抗原性，防止假阳性产生。

4 结论

本研究表达获得的融合蛋白具有良好的反应原性，可作为包被抗原应用于O型FMDV抗体检测试剂盒研发。

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（责任编辑 兰宗宝）