拮抗性山药内生菌的分离和筛选

摘要:通过研磨法和涂布平板法对山药(Dioscorea batatas Decne)不同部位的内生菌进行分离,共获得34株菌株,并对这些菌株作拮抗性筛选和生物学特性分析。结果表明,有4株菌株对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有明显的抑菌效果,抑制率均在24%以上,其中菌株HNSQSY04的抑制率最大,达52%;有1株菌株对大肠杆菌(Escherichia coli)有抑菌效果。对筛选出的4株菌株做了革兰氏染色和芽孢染色、菌体大小和生长曲线等特性分析,表明HNSQSY04的特征符合芽孢杆菌属,HNSQSY14、HNSQSY24和 HNSQSY31均有杆菌的特征。

关键词:山药(Dioscorea batatas Decne);内生菌;抑菌活性;分离;筛选

中图分类号:S432.4+2文献标识码:A文章编号:0439-8114(2014)10-2318-04

Isolation and Screening of Endophytes with Inhibition Activity

from Chinese Yam Rhizomes

ZHAO Long-fei

(College of Life Sciences, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000, China)

Abstract: A total of 34 endophytes were isolated from different parts of Chinese yam rhizomes by grinding method and spread plate method. Inhibition activity against pathogens and its biological characteristics were analyzed. The results showed that four strains preliminarily screened had obvious inhibition to Bacillus subtilis, with inhibition rates of above 24%. Strain HNSQSY04 had the maximum inhibition rate of 52%. One strain had inhibition activity to Escherichia coli. Gram staining, spore staining, growth curve of four strains screened were analyzed. Results showed that HNSQSY14, HNSQSY24, and HNSQSY31 had Bacillus genus features. HNSQSY04 had the features of the genus Gracilibacillus.

Key words: yam rhizome; endophyte; inhibition activity; isolation; screening

基金项目:国家自然科学基金项目(31204301);河南省高校青年骨干教师资助项目(2012GGJS166); 河南省科技厅科技攻关项目(112102110177);河南省教育厅科学技术研究重点项目(12A210019)

植物内生菌（Endophyte）是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物各种组织内部或细胞间隙，而不使宿主产生明显病理症状的微生物［1］。植物是内生菌的宿主并给内生菌提供营养，内生菌则产生具有一定生物活性的次生代谢产物，如植物生长调节剂、抑菌剂、杀虫物质、抗病毒成分等［2］，与植物形成共生互利关系，产生一定的生物防治和稳定生态环境的作用［3］。将植物内生菌作为生物防治菌不仅可避免因使用化学农药给环境带来的污染，还可避免杀死非靶标微生物和破坏植物根际土壤的微生态平衡，在防治植物病害方面有较大的应用潜力，成为国内外微生物研究的热点之一［3-5］。

山药（Dioscorea batatas Decne）为薯蓣科（Dioscoreaceae）薯蓣属（Dioscorea）多年生草质藤本植物薯蓣的块根，是中国传统的药食同源植物。它含有丰富的DHEA、蛋白质、糖类、黏液质、皂苷、维生素、胆碱、淀粉酶、糖蛋白、氨基酸、多酚氧化酶等成分。一些研究对山药的内生细菌和真菌进行了分离和筛选［2，6-8］，但鲜见对河南山药病原菌拮抗性内生菌系统研究的报道。本研究以河南山药为试验材料，筛选对细菌具拮抗作用的内生菌，并进行微生物学鉴定，以获取其基本信息，为山药拮抗菌的利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1山药惠楼山药,来自于河南省商丘市虞城惠店集乡楼村(砂壤土);铁棍山药,来自河南省焦作市温县(黏土)。

1.1.2试剂草酸铵结晶紫、卢戈氏碘液、番红、次氯酸钠、无水乙醇、孔雀石绿等。

1.1.3培养基 LB固体培养基:NaCl 10 g,酵母膏5 g,蛋白胨10 g,琼脂10 g,补水至1 000 mL,pH 7.2~7.4,121 ℃灭菌 20 min [9]。液体培养基不加琼脂。

牛肉膏蛋白胨液体培养基:牛肉膏3.0 g,蛋白胨10.0 g,NaCl 5.0 g,补水至1 000 mL,pH 7.2~7.4,121 ℃灭菌20 min[9]。固体培养基另加琼脂10 g。

高氏1号培养基:可溶性淀粉20 g,KNO3 1.0 g,NaCl 0.5 g,K2HPO4·3H2O 0.5 g, MgSO4·7H2O 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,琼脂20 g,补水至1 000 mL,pH 7.4~7.6,121 ℃灭菌30 min[9]。

1.2方法

1.2.1材料的表面消毒分别取山药的底部、中部、上部,先用无菌水冲洗2~3次;把山药放入75%乙醇中30 s,迅速取出再放入5%的次氯酸钠中3~8 min,然后用无菌水冲洗5~8次。最后一次冲洗过各部位的水用移液枪分别吸取500 μL涂平板,检测表面消毒是否彻底。

1.2.2内生菌的分离、纯化和保藏经表面消毒的山药组织2 g放入无菌研钵中,研磨至黏稠浆状[6],向研钵中加入18 mL无菌水,搅拌均匀,即制成10-1的菌悬液。取不同部位的山药研磨液,分别稀释成10-2、10-3、10-4 3个梯度。分别取山药不同部位研磨液的稀释液500 μL涂布平板,3个重复。置入恒温恒湿培养箱中30 ℃倒置培养,观察、记录结果。挑取单菌落,以划线分离法接种到培养基上28 ℃倒置培养24 h后镜检观察。重复操作,直至获得纯菌株。

1.2.3拮抗菌的筛选和鉴定

1)病原菌的活化。大肠杆菌(Escherichia coli CGMCC1.1103)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CGMCC1.769),为商丘师范学院生命科学学院微生物学教研室保藏。

将大肠杆菌和枯草芽孢杆菌以平板划线法转接到牛肉膏蛋白胨培养基上,置于培养箱中28 ℃倒置培养,活化后分别转接到牛肉膏蛋白胨斜面上,待斜面长饱满后暂时保藏于4 ℃冰箱备用。

2)拮抗菌筛选。采用滤纸片法[10]筛选对病原菌有抑制作用的内生菌。制备大肠杆菌菌悬液,用移液枪吸取200 μL涂布牛肉膏蛋白胨平板。在平板上均匀放置4个直径1.00 cm的圆形滤纸片,在滤纸片上加10 μL内生菌悬液,以滴加10 μL无菌水的作为空白对照,30 ℃恒温倒置培养。枯草芽孢杆菌的操作方法同大肠杆菌。观察并记录试验结果,选取具有抑菌效果的菌株复筛。复筛以相同方法进行,培养72 h后测抑菌圈直径(含滤纸片),每株菌3个重复。

3)抑菌效果的计算。病原细菌抑菌效果用抑制率衡量,抑制率=(处理抑菌圈直径-滤纸片直径) /滤纸片直径×100%[11]。

4)拮抗菌株形态学鉴定。参照参考文献[9],对内生菌分别进行革兰氏染色、芽孢染色、菌体形态和大小等的测定。

5)拮抗菌的生长特征。把筛选出的内生细菌接种到灭菌的LB液体培养基中,恒温振荡培养箱28 ℃ 130 r/min培养,每隔2 h取样一次,持续44 h。在波长为600 nm处测光密度。以光密度值(OD600 nm)为纵坐标、对应的培养时间(h)为横坐标绘制生长曲线。

2结果与分析

2.1内生菌的分离情况

铁棍山药和惠楼山药的不同部位共分离34株菌株,根据菌落特征初步判断其32株为细菌,2株为放线菌。

2.2拮抗菌的筛选和鉴定情况

对山药中分离的34株菌株进行抑菌筛选试验(图1、图2),筛选出4株拮抗菌株,其抑菌情况见表1。

从表1可见, HNSQSY04、HNSQSY14、HNSQSY24、HNSQSY31对枯草杆菌都有抑制作用,抑制率均在24%以上,其中HNSQSY04的抑制率最大,达52%。HNSQSY31对大肠杆菌表现出抑制作用且效果不明显,抑制率仅为12%,其他3株对大肠杆菌没有抑制作用。

2.3菌株形态学鉴定情况

菌株形态学鉴定结果见表2、表3、图3。由表2、表3可知,拮抗菌分别分离自惠楼山药的底部、上部以及铁棍山药的中部。筛选出的4株菌株的颜色不一致,菌落都较为湿润、易挑取;菌株HNSQSY04和HNSQSY31来自惠楼山药,菌落较小,边缘不规则,且菌落较薄,革兰氏染色分别呈紫色、红色,细胞都呈杆状,且前者有芽孢(图3);HNSQSY14和HNSQSY24来自铁棍山药,菌落较大,边缘规则,呈乳白色和浅棕色,革兰氏染色呈红色,为革兰氏阴性菌,无芽孢。

2.4拮抗菌的生长特征

拮抗菌的生长特征见图4。菌株HNSQSY04和HNSQSY24的潜伏期较短,4 h开始进入对数生长期,可见这2株的适应能力均较强,但后者的对数生长期较短,培养9 h已进入稳定期;而HNSQSY14和HNSQSY31在培养8 h后进入对数生长,14 h后进入稳定期,约31 h后,4株菌株可能因产生的次生代谢产物或营养匮乏开始进入衰亡期。

根据菌株的菌落特征,革兰氏染色、芽孢染色和菌体形态、大小特征,根据参考文献[12,13]进行鉴定,HNSQSY04符合芽孢杆菌属特征,HNSQSY14、HNSQSY24和HNSQSY31均有杆菌的特征。

3小结与讨论

1)以山药为材料,在从山药中分离出的34株菌株中发现有4株对枯草芽孢杆菌有抑菌作用,占总菌数的11.76%,抑菌率均在24%以上,其中菌株HNSQSY04对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最为明显,抑菌率达52%。而对大肠杆菌仅有1株有抑制作用。说明来自同一种宿主的内生菌对不同病原菌有不同的抑菌活性。但是内生菌在活体上对病原菌的抑制能力是否和体外一致,还需进一步的验证。

2)植物内生菌与寄主植物经长期的协同进化,形成互相依赖、和谐共处的关系,寄主植物为内生菌提供生境和生长发育所需的营养,植物体内有些内生菌对病原物具有拮抗作用或诱导寄主植物产生抗性,从而提高寄主植物的抗病性[14],能控制作物病害的内生菌是一种潜在而丰富的生防资源。内生菌在植物体内长期进化,可能拥有部分与宿主相同的基因,也可产生与宿主相同或相似的活性成分[15],宿主可为进行内生菌代谢产生活性成分的机理研究提供材料。

3)本试验从铁棍山药和惠楼山药中分离得到的内生菌株都属于杆菌,但具体的种属划分还需对内生菌进行生化试验、16S rDNA序列测定等进一步研究。这些菌株能否增加山药的抗病性,能否对除试验所用病原菌以外的病原菌有抑菌作用,还需进一步研究。

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