一株纤维素分解菌的筛选、鉴定及产酶特性研究

摘要：从兰州大尾羊、小尾寒羊、藏羊瘤胃液中分离出具有较强纤维素分解能力的菌株，测定其产酶特性，为进一步开发绵羊纤维素酶饲料添加剂奠定基础。进而采集新鲜瘤胃液，接种于羧甲基纤维素钠平板，通过刚果红染色和液体复筛培养基发酵培养，筛选出纤维素分解能力较强的好氧细菌。形态学、生理生化试验与16SrDNA序列分析方法相结合对细菌进行鉴定，同时对纤维素分解能力最强的1株细菌进行不同条件下酶活力测定。发现分离得到一株纤维素分解能力最强的菌株命名为SD-1。经分子生物学方法鉴定，该菌属芽孢杆菌。对SD-1进行独立单因子试验，发现SD-1最适发酵温度为40℃，最适发酵pH为6.5，最佳发酵时间为12 h，最佳碳源及氮源分别为淀粉和酵母浸出物。

关键词：SD-1；纤维素分解菌；酶活力

中图分类号：X70 文献标识码：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2018.04.003

秸秆纤维质是地球上最廉价、最丰富的有机资源。我国农作物秸秆产量每年就有6亿t左右[1]。由于纤维素外层被木质素所包裹，具有水不溶性的高结晶结构且含糖量较低，作为粗饲料时消化率较低。目前仍没有高效利用纤维素资源的方法，除了在饲喂牲畜、造纸、纺织、酒精发酵等方面利用一部分以外，其余大部分都被就地焚烧还田。不仅造成资源的极大浪费，还造成了严重的环境污染。运用微生物技术处理秸秆，提高粗饲料中蛋白质及可溶性糖含量被认为是有效解决这一问题的出路。前人通过酸碱及蒸汽处理纤维素[2-4]，但这些方法存在降解产物得不到较高回收且造成二次污染的弊端，使得应用受到极大限制。利用微生物产酶分解纤维素具有条件温和、产物回收率高、污染较小等优点，是当前研究如何高效利用纤维素的热点。主要的技术方法是利用微生物将秸秆中的纤维素等有机质降解转化为可利用的简单的低聚糖类、乙醇等能源或其它化工产品。产纤维素酶的微生物种类很多，目前国内外已分离筛选出53个属的数千个菌株[5-6]，这些菌种大多来自动物粪便、土壤、林场、造纸厂等。蔡勇等[7]从造纸厂腐烂纸浆中分离出一株碱性纤维素分解菌，该菌具有良好的热稳定性和pH稳定性，适用于洗涤工业酶制剂要求。白宝伟等[8]从棉秆腐解物中分离得到一株能够高效分解棉杆的真菌，该菌具有较强的耐高温性和耐碱性。王得武等[9]利用失重法及不同初始酸碱条件下研究纤维素分解菌群对不同纤维质材料的分解能力，结果表明所分离的菌群对秸秆类木质纤维材料具有较强的分解能力。付传明等[10]从腐烂植物及朽木分离纯化得到三株具有较强纤维素分解能力的丝状真菌，并通过诱变处理，使突变菌种较之前具有更强的纤维素分解能力。朱博雅[11]从玉米农田土壤中分离筛选得到一株链霉菌株，该菌株能够促进堆肥的腐熟。杨艳[12]从腐朽木材和枝条中分离得到一株链霉菌，通过不同生理条件下培养比较并对其产酶特性进行研究，从而对提高纤维素降解菌降解效率。刘晓梅等[13]利用杏鲍菇菌渣分离筛选出了高效分解纤维素菌株，为菌渣发酵腐熟堆肥提供了优质菌种。王少昆等[14]从科尔沁沙质草地土壤中分离得到一株伪弯头曲霉和一株尖孢镰刀菌，这两株菌对沙地凋落物分解和土壤有效养分输入起到促进作用。张盼等[15]从稻田腐质土壤中分离得到三株粪产碱杆菌和一株解糖假苍白杆菌，四株菌对秸秆的降解较自然降解均有较高效率。

瘤胃作为天然的、迄今已知降解纤维素能力最强的发酵罐，是反刍动物体内的饲料加工厂。瘤胃中生活着大量能够分解纤维素的微生物，包括细菌、真菌、古菌、原虫。目前人们也开展了一些从反刍动物瘤胃液中分离筛选纤维素分解菌的研究工作。刘玉承等[16]从绵羊瘤胃内容物中分离得到一株黄色瘤胃球菌和一株丁酸弧菌。周非帆[17]从蒙古绵羊瘤胃内容物中分离得到4株纤维素分解细菌，分别为粪肠球菌、拜氏梭菌、白色瘤胃球菌、丁酸梭菌。李润泫等[18]从牦牛瘤胃内容物中分离得到4种产纤维素菌株，这些分离的菌株可为下一步关于产纤维素酶对牦牛生理、生活的影响以及产纤维素酶的研究奠定良好的物质基础。作者从3种绵羊瘤胃内容物中分离纯化出一株纤维素分解能力较强的细菌，对该菌在不同pH、温度、碳源、氮源、培养时间等理化因素下进行酶活测定，旨在检测该菌在分解纤维素方面的最佳条件，为生产微生物制剂及饲料添加剂提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

瘤胃内容物均来自永靖县瑞霖养殖科技有限公司，健康状况良好的兰州大尾羊、小尾寒羊、藏羊。无菌采集瘤胃内容物经四层纱布过滤后带回实验室，添加10%甘油后置于-80℃冰箱备用。

1.2 培养基及溶液

羧甲基纤维素钠（CMC-Na）固体培养基、羧甲基纤维素钠液体复筛培养基、0.5%葡萄糖标准溶液、3，5-二硝基水杨酸显色液（DNS液）、CMC-Na磷酸缓冲液、1M NaCl 溶液。

1.3 方法

1.3.1 纤维素分解菌的分离及初筛

取新鲜瘤胃液适当稀释，涂布于羧甲基纤维素钠平板，37℃恒温培养12 h。加入1 mg/mL的刚果红染液适量，30 min后弃去染液，加入适量1mol/L NaCl 溶液洗涤15 min，将菌落水解圈直径与菌落直径比值（D/d）较大的菌种进一步分离纯化，得到菌体的纯培养。经反复分离筛选得到D/d值较大的菌株若干。

1.3.2 菌种复筛

将初筛后水解圈较大的菌种接种于液体复筛培养基，37℃、225rpm连续发酵16 h，菌液经8000rpm、4℃离心10 min，所得上清即为粗酶液，通过测定粗酶液的活性，筛选出纤维素分解能力最强的菌株SD-1。

1.3.3 菌种16SrDNA法鉴定

1.3.3.1 菌种基因组DNA提取

使用試剂盒TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction kit ver.2.0进行菌种基因组DNA提取。采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.3.3.2 引物设计

根据细菌16SrDNA保守区段设计引物为：27F：5´-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3´，1492R： 5´-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3´。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3.3.3 PCR扩增

PCR扩增体系：DNA模板0.8μL，上下游引物各0.4μL，2×Power Taq PCR MasterMix 11μL，加ddH2O至20μL。

PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸45s，循环30次，72℃再延伸8 min，4℃保存。PCR产物采用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.3.4 进化树的构建

将经过PCR扩增后特异性良好的产物移交测序，获得SD-1菌种16SrDNA序列信息。将得到的碱基序列通过Genbank比对后构建出系统进化树。测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

1.3.4 葡萄糖標准曲线的绘制

分别取0.5%葡萄糖标准液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0（mL）至50 ml容量瓶，定容至刻度，各取1.5 ml至比色管中，加入1.5 ml DNS液于沸水中水浴5 min，冷却后稀释8倍并测量不同含量葡萄糖标准液540 nm下吸光度值。利用Excel 2010软件，以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量（酶活力）为横坐标，绘制标准曲线，曲线回归方程为A540=0.0737U-0.0025，R2=0.9994，线性关系良好，能够用于酶活力的测定。

1.3.5 菌体生长测定

发酵培养基经适当稀释，在600 nm紫外光处测其吸光度值，记为A600 nm。参比物为稀释相同倍数的未接种培养基。

1.3.6 羧甲基纤维素酶活（CMCase）测定

加入1 mlCMC-Na磷酸缓冲液（pH4.5）于比色管内，加入0.5 ml粗酶液，50℃水浴30 min后迅速加入1.5 ml DNS液置于沸水浴中5 min。作空白对照为加入CMC-Na磷酸缓冲液及粗酶液后直接加1.5 ml DNS液，沸水浴5 min。测定其在540 nm处的吸光度值。将在上述反应条件下由底物转变为10 ug 还原糖所需酶量定义为一个酶活力，以U/ml表示。

1.4 各独立单因子对菌体产酶的影响

1.4.1 pH对SD-1产酶的影响

设置产酶发酵培养基pH梯度为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。接菌后于37℃、225rpm培养16 h测其A540 nm并计算酶活及其菌体A600 nm值。

1.4.2 温度对SD-1产酶的影响

设置温度梯度为25℃、28℃、31℃、34℃、37℃、40℃、43℃、46℃、49℃，在最适pH下发酵16 h，测其A540 nm并计算酶活及其菌体A600 nm值。

1.4.3 培养时间对SD-1产酶的影响

设置发酵培养时间分别为12 h、17 h、22 h、27 h、32 h、37 h、42 h、47 h，在最适温度和pH条件下进行发酵，测其A540 nm并计算酶活及其菌体A600 nm值。

1.4.4 不同碳源对SD-1产酶的影响

分别设置CMC-Na、淀粉、滤纸为唯一碳源在最适温度、pH及发酵培养时间条件下进行发酵培养，测定不同碳源培养下菌种产酶活力。

1.4.5 不同氮源对SD-1产酶的影响

分别设置牛肉膏、蛋白胨、酵母浸出物为唯一氮源，在最适温度、pH、发酵培养时间，碳源，测定不同氮源培养下菌体产酶活力。

2 结果分析

2.1 菌株的分离、筛选与形态学鉴定

通过刚果红染色使产纤维素酶的菌落周围产生水解圈的方法，从羊瘤胃液中分离得到若干菌株，经过连续纯化培养对D/d值的比较及液体培养基复筛，得到产纤维素酶能力最强的菌株SD-1。SD-1在羧甲基纤维素钠琼脂平板上水解圈见图1。

形态学观察发现SD-1菌落表面粗糙不透明，褶皱隆起，边缘不齐。菌落整体呈白色，可见芽孢。对其进行革兰氏染色发现该菌为革兰氏阳性且呈杆状。

2.2 16SrDNA 法鉴定SD-1菌种

SD-1菌种16SrDNA序列扩增结果见图2，扩增产物大小为1500bp左右，与预期片段大小相符，条带清晰且无杂带，特异性良好，能够用于测序分析。

2.3 pH对SD-1生长及产酶的影响

由图4可知SD-1最适产酶pH及最适生长pH均为6.5。

2.4 温度对SD-1生长及产酶的影响

由图5可知，在pH6.5条件下，SD-1最适生长温度为34℃，最适发酵温度为40℃。

2.5 培养时间对SD-1生长及产酶的影响

由图6可知，在最适温度、pH条件下，SD-1最适生长时间为22 h，最适发酵时间为12 h。

2.6 不同碳源对SD-1产酶的影响

由图7可知，SD-1发酵最适碳源为淀粉。

2.7 不同氮源对SD-1生长及产酶的影响

由图8可知，SD-1最适发酵氮源为酵母浸出物，最适生长氮源为蛋白胨。

3 讨论

瘤胃中50%的纤维素的分解被认为是瘤胃细菌、真菌、原虫共同作用的结果，而在这个过程中的近80%是由细菌完成的[19]。瘤胃微生物产生的酶分布于瘤胃液，附着在饲料颗粒上和微生物菌体上，内源葡聚糖酶和外源葡聚糖酶存在于细胞表面或细胞质中。而β-葡糖苷酶和β-岩藻糖苷酶的糖苷降解酶主要存在于瘤胃液中。这表明瘤胃内纤维素分解菌与附着在植物细胞壁的菌对纤维质的分解至关重要。根据瘤胃液所含微生物数量及分泌的酶，瘤胃液中所分布的酶在瘤胃饲料降解中具有重要作用[20]。Martin认为在瘤胃各部分15N 标记微生物生物量中，固体附着微生物及其酶活约占瘤胃总微生物量及总酶的74%[21]。本实验中，作者从藏羊新鲜瘤胃液中筛选出一株纤维素分解能力较强的菌种SD-1，形态学观察、生理生化试验及16SrDNA序列比对相结合的方法鉴定该菌种为一株芽孢杆菌。SD-1产酶在pH 5.0～6.5、37～43℃内水平较高，其中在pH6.5、40℃、发酵12 h条件下，菌种产酶活力最高，为12.8U/ml。碳源、氮源也是影响菌体生长及产酶代谢的直接因素。实验中，SD-1在3种碳源（CMC-Na、淀粉、滤纸）培养下，其产酶活力均在10U/ml以上，说明该菌种对不同的碳源均有较强的分解能力。而在不同氮源培养条件下，SD-1菌种的产酶能力较低。在以酵母浸出物为唯一氮源的培养基中，其最高产酶活力为7.3U/ml。这可能是由于单一氮源不能满足菌种产酶代谢的需要。

目前已有将纤维素分解菌作为生物制剂及利用纤维素分解菌生产乙醇等能源物质的例证。张海峰[22]将构建的黑曲霉基因工程菌和酿酒酵母基因工程菌固态发酵水稻秸秆，通过原位产酶及同步糖化发酵工艺，乙醇产量提高16.8%。夏素银等[23]通过对苜蓿草粉饲粮添加纤维素酶对蛋鸡生产性能、蛋品质及养分利用率的影响的研究发现高水平的苜蓿草粉组添加纤维素酶后，使蛋鸡粗蛋白质、钙和粗纤维的消化率有改进。反刍动物的瘤胃作为天然的发酵罐具有高效分解利用纤维素的功能。通过利用纤维素酶发酵生产有机饲料及产生乙醇等能源物质是高效利用纤维素资源的有效途径。利用纤维素分解菌处理秸秆，可使其含有多种酶解糖、易于消化。从饲喂安全角度考虑，从瘤胃中分离得到的纤维素分解菌可制备成饲料添加剂，理论上讲，这种饲料添加剂易于动物对纤维素的消化利用，提高安全性和适应性。

4 结论

本实验中，作者从藏羊瘤胃液中分离出一株纤维素分解能力较强的菌种SD-1，经形态学观察、生理生化试验及16SrDNA 序列比对法鉴定为一株芽孢杆菌，其最适产酶pH为6.5、最适温度为40℃、最佳发酵时间为12 h、最佳碳源和氮源分别为淀粉和酵母浸出物。研究结果可以为制备生物制剂或饲料添加剂及乙醇等能源物质，以解决当前秸秆等纤维素资源过度浪费提供一定的理论参考。

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