含碘的乳过氧化物酶—过氧化氢—硫氰化物系统对变异链球菌致龋性的影响

[摘要] 目的 研究含不同浓度碘（I-）的乳过氧化物酶-过氧化氢-硫氰化物系统（LPO-H2O2-SCN-）对变异链球菌生长、黏附、产水不溶性细胞外多糖以及葡萄糖基转移酶（GTF）活性的影响。方法 选用S. mutans ATCC 25175为实验菌株。采用菌落形成单位（CFU）计数法进行生长实验；用分光光度计法测定细菌的黏附抑制率；用蒽酮法测定水不溶性细胞外多糖的质量浓度；用蒽酮法测定还原糖量，计算GTF活性。结果 随着I-浓度的增高，含I-的LPO-H2O2-SCN-抗菌系统对S. mutans致龋力的抑制作用增强。当I-≥100 μmol·L-1时，对S. mutans的生长抑制明显高于对照组（P<0.05）；且当I-≥1 000 μmol·L-1时，对S. mutans的生长抑制显著高于以硫氰酸盐（SCN-）为单底物的实验组（P<0.05）；当I-≥100 μmol·L-1时，对S. mutans的黏附抑制率达到50%以上，水不溶性细胞外多糖生成量明显减少（P<0.05），GTF活性也明显降低（P<0.05）。结论 通过增加I-的浓度，可以抵消生理浓度的SCN-的抑制作用，使含I-的LPO-H2O2-SCN-系统能显著抑制变异链球菌的生长、黏附、水不溶性细胞外多糖生成和GTF活性。

[关键词] 变异链球菌； 乳过氧化物酶； 碘离子； 硫氰酸根离子； 葡萄糖基转移酶； 水不溶性细胞外多糖

[中图分类号] R 780.2 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.04.020

唾液过氧化物酶系统（peroxidase system，PS）是唾液中的抗菌成分，主要包括3个组分：过氧化物酶（peroxidase，PO）、过氧化氢（peroxide，H2O2）和底物，底物包括含硫氰酸根离子（thiocyanate，SCN-）、碘离子（iodine，I-）等的化合物。只有当3个组分都存在时，PS才具有活性。PO可催化H2O2将含I-、SCN-的底物分别氧化为次碘盐OI-、次硫氰酸盐OSCN-[1]。OI-和OSCN-均为强氧化剂，能氧化对巯基敏感的酶，干扰微生物代谢，有效抑制多种细菌和真菌的生长[2]。口腔PO主要存在于口腔唾液和龈沟液中，主要由唾液过氧化物酶（salivary peroxi-dase，SPO）和髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）组成。SPO和MPO不易获取，至今尚未得到纯品。乳过氧化物酶（lactoperoxidase，LPO）存在于乳汁中，因其来源广泛，容易获取，结构和功能与SPO非常相似，所以实验中多以LPO作为SPO的替代物。乳过氧化物酶系统（lactoperoxidase system，LPS）已应用于多种口腔保健品中[3]，这些口腔保健品中多以SCN-作为底物，I-的应用还较少。虽然I-氧化产物的抑菌效果远远超过SCN-氧化产物，但是唾液中固有的生理浓度的SCN-存在时会显著抑制LPO-I-的抗菌效应[4]，所以LPO-I-系统的抗菌效应未能得到有效的开发和利用。

本研究拟通过增加I-的量来抵消生理浓度SCN-对I-的抑制作用，从而探索有效发挥I-抗变异链球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）作用的途径，并进一步研究含不同浓度I-的LPO-H2O2-SCN-抗菌系统对S. mutans的黏附、葡萄糖基转移酶（glucosyltrans-ferase，GTF）活性和水不溶性细胞外多糖生成等多个致龋毒力因子的影响，为I-在防龋口腔保健中的应用和推广提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验菌株与主要试剂

S. mutans ATCC 25175（血清型C，由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供）；脑心浸液补充（brain heart infusion-supplemented，BHI-S）琼脂培养基、脑心浸液（brain heart infusion，BHI）液体培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司）；硫氰酸钾、碘化钾、30%H2O2（天津市福晨化学试剂厂）；LPO（Sigma公司，美国）；二硫苏糖醇（di-thiothreitol，DTT）（北京索莱宝科技有限公司）。

1.2 溶液Ⅰ的配制

溶液Ⅰ（当实验中底物为I-和SCN-时，pH值为6.5）配方[4]如下：9 mmol·L-1 Na2HPO4 0.651 g，

24 mmol·L-1 KH2PO4 0.656 g，1.5 mmol·L-1 MgSO4 0.036 g，67 mmol·L-1 Na2SO4 1.922 g，加蒸馏水溶解稀释至200 mL，调节pH值为6.5，备用。

1.3 细菌的复苏及培养

将S. mutans冻干粉菌株接种于BHI-S琼脂培养基上于37 ℃及80%N2、10%H2、10%CO2环境下培养48 h，鉴定为纯培养物后，接种于BHI液体培养基培养24 h，收集细菌，并用溶液Ⅰ调整，调整溶液Ⅰ的菌悬液密度，使其OD600=0.9，备用。

1.4 试剂的配置及分组

实验中分别配制LPO（5 μg·mL-1），H2O2（终浓度100 μmol·L-1），SCN-（终浓度1 mmol·L-1）和I-（终浓度分别为0、10、100、1 000、10 000 μmol·L-1）。将S. mutans分为6组，分别加入不同的试剂：5个实验组分别加入不同浓度I-，并设1个对照组；每组又分为A、B管，A管加H2O2、SCN-和I-，不加LPO；B管加H2O2、SCN- 、I-和LPO。

1.5 含I-的LPO-H2O2-SCN-系统对S. mutans生长的影响

将S. mutans分为6组，每组加入0.1 mL菌悬液，2.5 mL SCN-，B管加2.5 mL LPO（A管以2.5 mL溶液Ⅰ代替），2.5 mL I-，2.5 mL H2O2，对照组加10.0 mL溶液Ⅰ。30 min后加10 μL DTT（终浓度为1 mmol·L-1）终止反应，进行10倍系列稀释得到3个浓度梯度，将稀释液体涂布到BHI琼脂培养皿上，厌氧培养24 h，计数菌落形成单位（clonal formation unit，CFU），换算成lgCFU·mL-1。

1.6 含I-的LPO-H2O2-SCN-系统对S. mutans黏附作用

的影响

取菌液0.3 mL，与含2%蔗糖的BHI液体培养基按体积比1∶10的比例接种S. mutans，各组加入 SCN- 0.1 mL，I- 0.1 mL，H2O2 0.1 mL，B管加入LPO 0.1 mL（A管以0.1 mL溶液I代替LPO），对照组加0.4 mL溶液Ⅰ，30 min后加DTT终止反应，试管与水平面呈30°，厌氧培养48 h后收集试管壁上黏附的细菌，置于分光光度计下测量OD600值，计算细菌的黏附抑制率。黏附抑制率=（对照组OD600-实验组OD600）/对照组OD600×100%。

1.7 含I-的LPO-H2O2-SCN-系统对S. mutans生成水不

溶性细胞外多糖的影响

试剂加入量同步骤1.6。取菌液0.3 mL，与含2%蔗糖的BHI液体培养基按体积比1∶10的比例接种S.

mutans，加入各试剂反应30 min后加DTT终止反应，厌氧培养24 h后离心收集细菌，蒸馏水洗涤，再用0.5 mol·L-1 NaOH洗涤，收集上清液，用蒽酮法检测水不溶性细胞外多糖的质量浓度（μg·mL-1）。

1.8 含I-的LPO-H2O2-SCN-系统对S. mutans GTF活性

的影响

试剂加入量同步骤1.6。取菌液0.3 mL，与含2%蔗糖的BHI液体培养基按体积比1∶10的比例接种S. mutans，加入各试剂反应30 min后加DTT终止反应，厌氧培养24 h后离心收集上清液，用盐析法提取GTF粗酶，蒽酮法测定酶-底物反应液中的还原糖量，计算GTF活性。

1.9 统计学分析

实验数据由SPSS 17.0软件进行统计学处理，采用t检验比较相同I-浓度组A、B管间S. mutans数量是否有差异，各组总体均数的比较采用单因素方差分析，各组间均数的两两比较采用LSD检验，两变量之间的相关分析采用Pearson检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 含I-的LPO-H2O2-SCN-系统对S. mutans生长的影响

各组的lgCFU·mL-1见图1。A管不加LPO，各实验组与对照组之间lgCFU·mL-1无明显差异。B管加入LPO，反应30 min后，各实验组lgCFU·mL-1较A管明显变小，差异有统计学意义（P<0.05）；随着I-浓度的升高，lgCFU·mL-1逐渐减小，当I-≥100 μmol·L-1时，实验组lgCFU·mL-1明显地低于对照组，其差异有统计学意义（P<0.05）；当I-浓度分别为1 000、10 000 μmol·L-1时，实验组间两两比较均有明显差异（P<0.05）。

2.2 含I-的LPO-H2O2-SCN-系统对S. mutans黏附作用

的影响

A管不加LPO，各实验组和对照组间OD600值无明显差异；B管加入LPO反应30 min，各实验组OD600值较A管明显变小（图2）。B管各组OD600测量值和黏附抑制率见表1，可见随着I-浓度的升高，OD600值减小，LPO-H2O2-SCN-抗菌系统对S. mutans的黏附抑制率升高。除10、100 μmol·L-1浓度组外，其他I-浓度组间的差异有统计学意义（P<0.05）；且各实验组与对照组间的差异均有统计学意义（P<0.01）。当I-≥100 μmol·L-1时，对S. mutans的黏附抑制率达到50%以上。

2.3 含I-的LPO-H2O2-SCN-系统对S. mutans生成水不

溶性细胞外多糖的影响

各组S. mutans生成水不溶性细胞外多糖的质量浓度见图3。A管中，各实验组和对照组间水不溶性细胞外多糖的质量浓度无明显差异（P>0.05）。B管加入LPO反应30 min后，水不溶性细胞外多糖的质量浓度较A管明显降低，其差异有统计学意义（P<

0.05）；随着I-浓度的升高，水不溶性细胞外多糖的质量浓度随之减少，当I-≥100 μmol·L-1时，水不溶性细胞外多糖生成量明显减少，与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.4 含I-的LPO-H2O2-SCN-系统对S. mutans GTF活性

的影响

各组S. mutans的GTF活性见图4。A管中，各实验组和对照组间S. mutans GTF活性的差异无统计学意义（P>0.05）。B管加入LPO反应30 min后，GTF活性较A管明显变小，其差异有统计学意义（P<0.05）；且随着I-浓度的升高，GTF活性降低，除0和10 μmol·L-1外，其余各组GTF活性的总体均数间的差异均有统计学意义（P<0.05）；各实验组与对照组均数之间的差异也有统计学意义（P<0.05）。

2.5 GTF酶活性与水不溶性细胞外多糖含量的Pear-

son相关分析

以GTF酶活性为自变量，水不溶性细胞外多糖的质量浓度为因变量，经Pearson相关性分析，二者之间有明显的正相关关系（r=0.806，P=0.000）。

3 讨论

I-为底物时，LPO-H2O2-I-抗菌系统的有效杀菌成分主要为碘及其氧化物、单线态氧等物质[5]。碘和碘氧化物可以与蛋白质氨基酸侧链基团结合导致蛋白质变性沉淀；也能氧化核酸，破坏DNA和rRNA等[6]；另外，碘还可氧化攻击还原型辅酶Ⅱ进而影响细菌代谢[7]。单线态氧是高活性氧化基团，可以氧化损伤微生物细胞膜，氧化攻击蛋白质和酶，也能与DNA分子中的鸟嘌呤反应，影响酶的合成，干扰细菌代谢[8]。由此可见，LPO-H2O2-I-抗菌系统有多种机制可以共同作用导致微生物生长抑制或死亡。

本实验中，各组均设置了A、B两个管，A管不加LPO，底物（I-、SCN-）不能被H2O2氧化为OI-、OSCN-等物质，含不同浓度I-的LPO-H2O2-SCN-系统的抗菌效应无法发挥，仅在I-（10、100、1 000、

10 000 μmol·L-1）和微量H2O2（100 μmol·L-1）作用下，S. mutans的生长、黏附、产水不溶性细胞外多糖和GTF活性的抑制作用并不明显。B管加入LPO反应30 min，底物（I-、SCN-）被氧化，含不同浓度I-的LPO-H2O2-SCN-抗菌系统可以显著抑制S. mutans生长、黏附、产水不溶性细胞外多糖和GTF活性。这说明，虽然I-有一定的抑菌作用，但是LPS抗菌效应的发挥依赖于氧化性物质（碘及其氧化物、单线态氧等）的生成，同时也说明只有当LPO、H2O2和底物（SCN-、I-等）这3个组分同时存在时，LPS才能显示出强大的抗菌活性[9]。

B管在实验时间（30 min）内，随着I-浓度的升高，抗菌系统抑制S. mutans生长的能力增强，当I-浓度达到1 000 μmol·L-1时，含双底物的LPS对S. mutans的抑制作用明显高于只含SCN-的实验组，说明随着I-浓度增加，生理浓度的SCN-对LPO-H2O2-I-的竞争性抑制作用可以被抵消，且当I-浓度足够大时可发挥显著的抗菌作用。

黏附实验中B管结果显示，随着I-浓度的升高，黏附S. mutans的OD600值减小，含不同浓度I-的LPO-H2O2-SCN-抗菌系统对S. mutans的黏附抑制率升高，在I-浓度增至100 μmol·L-1时，黏附抑制率超过50%。虽然LPO-H2O2-SCN-抗菌系统和含不同浓度I-的LPO-H2O2-SCN-抗菌系统都可有效抑制S. mutans黏附，但随着I-的加入，抗菌系统抑制S. mutans黏附能力显著增强。含I-的LPO-H2O2-SCN-抗菌系统的自由基（单线态氧等）和底物的活性氧化态（OSCN-/HOSCN和OI-/HOI）可能通过氧化氨基酸残基、使S. mutans黏附素、GTF和葡聚糖结合蛋白（glucan-binding protein，GBP）失活而抑制其黏附能力。

于晓霞[10]采用闪烁计数法测定酶活性，发现LPO可抑制GTFD的活性。Korpela等[11]的研究结果表明，LPO-H2O2-SCN-抗菌系统可抑制吸附于羟磷灰石上的GTFC和GTFD活性。本实验结果也表明，含I-的LPO-H2O2-SCN-抗菌系统能够有效抑制GTF的活性和水不溶性细胞外多糖的生成，且抑制能力随着I-浓度的升高而增强。经Pearson相关检验，GTF活性与水不溶性细胞外多糖含量之间有明显的正相关关系（r=0.806，P=0.000），含I-的LPO-H2O2-SCN-抗菌系统抑制了GTF酶的活性，则水不溶性细胞外多糖含量也随之减少。由此结果可见，除了强大的抑菌作用，含I-的LPO-H2O2-SCN-抗菌系统防治龋病的另一主要机制可能是抑制GTF活性，进一步抑制了S. mutans的黏附能力和降低了水不溶性细胞外多糖的生成。

综上所述，只有当3个组分（LPO、H2O2和底物）都存在时，LPS才能显示出强大的抗菌活性；增加I-的浓度，可以抵消生理浓度的SCN-的抑制作用，使含I-的LPO-H2O2-SCN-抗菌系统发挥显著的抑制S. mutans生长、黏附、生成水不溶性细胞外多糖和GTF活性的作用；因此LPO-I--H2O2系统在预防龋病方面有着比较优越的应用前景，有望成为一种有效的防龋药物。

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（本文编辑 吴爱华）