牛支原等温扩增冻干试剂盒研究

摘 要：目的：针对牛支原体相关疾病的主要特点，对有效的治疗药剂进行研究，通过药剂制备实验，找出最为便捷敏感的诊断试剂。方法：根据已有的牛支原体疾病行管研究文献，构建相关细胞模型，制备浓度符合要求的实验溶液，将其当做实验对照品应用，并显色溶液以及冻干品型溶解溶液准备好，对多种不同的冻干试剂进行组合实验应用。设置等温增扩实验条件，设计多种保护剂组方，将相应的干燥时间充分优化，确保每一次干燥时间都保持高度精准，对试剂盒的主要特异性进行考察，同时对其稳定性进行了解。结果：在本次关于冻干型试剂盒的研究实验中，对8种不同的符合条件的保护剂进行了研究，对基本的扩增情况进行了考察，最终发现部分保护剂并不会给等温扩增现象带去影响，一次干燥現象的基本升温时间为3小时，相对地干燥时间为6小时，二次干燥工作消耗了4小时。结论：本文探讨的这种冻干型试剂盒具有多种应用优势，适合被应用于牛疾病监测工作之中。

关键词：牛支原体；等温扩增；试剂盒

牛支原体是一种在牛养殖环节中极为常见的病原体，存在这种病原体的牛感染乳腺炎、牛肺病的几率是比较大的。这种病原体分布范围极为广阔，我国的牛养殖工作也会受到这种病原体的影响，部分牛因存在牛支原体，而出现了严重的坏死性肺炎，导致牛的死亡率升高，一般出现牛大量死亡的情况，养殖者需承担极为严重的经济性损失。因此为了消除牛支原体疾病带来的影响，给牛提供的病情诊断工作就显得尤为关键，一般情况下，兽医会选择应用病原鉴定与分离技术来对牛存在的疾病进行判断，但是牛支原体存在生长速度相对缓慢的问题了，在对相应的菌落情况进行观测时，需要消耗极多的时间，等温扩增检测技术比较适合被用于该种疾病检测工作中，本文对开展等温扩增检测工作时需要应用的冻干型试剂的相关情况进行研究。

1 材料与方法

1.1 一般材料

牛支原体PG45株（ATCC）、牛支原体HB-1株、牛支原体SD-2株、牛鼻支原体（ATCC）和无乳支原体（ATCC），均接种于含有2.59酵母粉和20%马血清的类胸膜肺炎微生物肉汤培养基（PPLO）中，在含有5%CO2的37℃温箱中培养；多杀性巴氏杆菌931株（CVCC），接种于ISB培养基中，37℃条件下培养；牛结核杆菌菌液。

1.2 方法

冻干保护剂的初步筛选：选取常用的冻干疫苗耐热保护剂如蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、甘氨酸、牛血清白蛋白、酪蛋白和水解乳蛋白，作为等温扩增试剂的耐热冻干保护剂原料。向等温扩增试剂中分别加入上述保护剂；其中海藻糖的浓度为10%（质量体积比，w/v），其他物质的浓度均为5%（质量体积比，w/v），以不添加任何保护剂的等温扩增试剂作为对照。40℃冷冻4h后；置室温溶解，加入浓度为104拷贝/μL的阳性对照品，恒温仪中63℃反应1h。反应结束后，采用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并据此筛选对等温扩增反应没有影响的冻干保护剂。

等温扩增试剂共晶点的测定：按最佳的冻干保护剂组方配制等温扩增试剂，加至西林瓶中。再将共晶点测试探头伸入西林瓶中的液面下，通过记录软件可以记录等温扩增试剂由液态变为固态过程中电阻率的变化。等温扩增试剂的温度曲线和电阻率曲线的交叉点即为等温扩增试剂的共晶点。

等温扩增冻干试剂盒的组装与使用方法：等温扩增冻干试剂盒主要包括等温扩增试剂冻干品、甜菜碱溶液、阳性对照品溶液和显色液。用时将甜菜碱溶液加入等温扩增混合物冻干品中溶解，加至PCR反应管中，每管20μL。向各PCR管中加入样品液或阳性对照品，同时用纯净水做阴性对照。

敏感性检验：用天根质粒小提试剂盒提取质粒，通过微量分光光度计测定质粒浓度，进行10倍连续倍比稀释，按100-105个拷贝浓度加至等温扩增反应体系中，用等温扩增冻干试剂盒进行扩增，扩增产物可通过颜色变化和琼脂凝胶电泳方法进行检测。

特异性检验：取牛支原体PG-45株、HB-1株以及SD-2株菌液，活菌计数后用无菌水稀释至104CCU-mL-1。同时，取牛鼻支原体菌、无乳支原体菌液、多杀性巴氏杆菌、结核分枝杆菌，置水浴中煮沸10min后冷却，同时用等温扩增冻干试剂盒进行检测，通过颜色变化或琼脂凝胶电泳方法判断阴阳性。

2 结果

冻干保护剂的初步筛选：保护剂的初步筛选结果表明，只有添加10%w/v海藻糖、5%w/v甘露醇或牛血清白蛋白的等温扩增试剂能进行正常的扩增反应，其它保护剂均会抑制扩增反应。

一次干燥时，由于干燥时间过长，导致制品表面形态较差，而干燥的升温时间选择2h和3h进行试验。结果表明，干燥时间为3h时，制品的水分含量过高，说明干燥温时间为2h时，虽然制品的外观性状较好，但是升温速度过快，通过时间过短。由此，选择6h为一次干燥的干燥时间。

等温扩增冻干试剂盒的敏感性检测：以不同浓度梯度的质粒P-uvrC为模板，利用等温扩增冻干试剂盒检测敏感性，显色与凝胶电泳结果均表明，等温扩增冻干试剂盒最低可检测到10个拷贝的质粒。

等温扩增冻干试剂盒的特异性检测：阴性对照显褐色且无条带，阳性对照显绿色且有典型条带，证明对照成立。牛支原体PG45株、HB-1株以及SD-2株经等温扩增冻干试剂盒检测，均显绿色和典型的梯形条带，判定为阳性；牛鼻支原体、无乳支原体、多杀巴氏杆菌和结核杆菌经试剂盒检测，均显褐色且无典型条带，判定为阴性。

3 讨论

针对牛支原体类疾病的基本检测需要，相关人员提供了等温扩增检测技术，将检测温度调节为恒温，检测工作在1个小时之内就能被完成，从集体的牛支原体检测工作中，可以发现该种检测方法具有比较高的灵敏度，同时还存在特异性优势，可以被应用到多种病原检测工作之中，该项检测技术对于应用者的技术水平限制比较宽松，因此在基层医疗领域之中也可被应用。但是实际应用问题也是存在的，构建标准的等温扩增检测系统后，其中的酶物质比较容易出现降解的情况，检测人员不能对检测样品进行长期保存，在运输过程中样品也会出现变化，在对牛支原体相应的疫苗进行制备时，一般会借用干燥冷冻技术来对便于储存的冻干型疫苗加以制备，在处理等温扩增检测环节之中需要使用的各种试剂时，也可以选择应用这种冻干方法，在制备相应的试剂盒时，同样需要对稳定性、特异性以及敏感性进行考察，本文从这个角度展开研究，最终获得了相对理想的实验结果，冻干应用效果比较理想。

冷冻干燥技术属于一种可靠度比较高的通用方法，其在保持生物类型的制品的稳定性方面有比较好的应用效果，为了应对具体的冻干应用问题，相关的冻干技术还需被从多个角度加以改进。

参考文献

[1]秦明明.牛奶中支原体的检测及牛支原体LAMP诊断方法的建立[J].中国农业科学院，2016.

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