一株生物乳化剂产生菌的筛选及其特性研究

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摘要：从滨州地区石油污染盐碱土壤中分离出一株具有高产生物乳化活性的菌株SJ，经生理生化试验和16S rRNA测序分析，初步鉴定为该菌株属于沙雷氏菌属，命名为Serratia sp. SJ。对菌株SJ的生长条件进行了研究，结果表明：菌株SJ对NaCl的最适生长范围为0%～4%，生长最适pH值范围是7～10。菌株经发酵培养，测定发酵液对柴油的乳化指数为100%。采用盐沉法从发酵液中提取到生物乳化剂，得率为0.75 g/L。经定性和定量分析，该乳化剂由糖类、蛋白质和脂类三部分组成，比例分别为34.7%、41.5%和16.0%。菌株SJ及其产生的生物乳化剂在石油污染治理方面具有潜在的应用价值。

关键词：乳化剂；乳化剂提取；生理生化鉴定；耐盐菌；耐碱菌

中图分类号：Q939.9

文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2015）10-0279-03

1 引言

生物乳化剂是一类由微生物代谢产生的大分子生物表面活性物质，大多是由多糖、蛋白质、脂质，或者这些物质的复合物组成[1～3]。乳化剂可以将油滴乳化成许多细小的颗粒，从而增大油滴可利用的表面积，有利于微生物的直接接触和利用，可以极大地改善微生物对油污土壤的净化效果[4]，成为石油污染治理中的研究热点[5]。

国内对乳化剂也有广泛的研究。朱万琴[6]等人就对乳化剂菌株进行了初步筛选和研究；李彩凤等人，研究了高温产乳化剂菌株SL-1的最适生长条件，并对乳化剂进行了定性分析和研究。李国强[3]等人对嗜热解烃菌DM-2产生的乳化剂进行了详细的研究。然而，少见来自盐碱环境中产生物乳化剂微生物的分离和研究的相关报道。

滨州地区位于黄河下游、鲁东平原、地处黄河三角洲腹地，北邻渤海湾。土壤以盐碱土为主，土壤中参照的微生物抗逆性较强。本实验从该地区石油开采区采集石油污染土壤，分离得到一株高产生物乳化剂的菌株SJ，对菌株的耐盐碱特性、产生物乳化剂条件，以及乳化剂的理化性质进行了研究。

2 材料与方法

2.1 土壤样品

本实验所用土样采集自滨州地区石油开采区。

2.2 实验材料

富集培养基[7，8]：K2HPO44.35 g，KH2PO41.7 g，NH4CL2.1 g，MgSO40.2 g，MnSO40.05 g，FeSO4·7H2O0.01 g，CaCl2·2H2O0.03 g，石蜡5%。

发酵培养基[7，8]：K2HPO4·3H2O4.8 g，KH2PO41.5 g，（NH4）2SO41 g，柠檬酸三钠0.5 g，MgSO4·7H2O0.2 g，葡萄糖2 g，酵母提取物0.1 g，CaCl2·2H2O0.002 g，MnCl2·4H2O0.0004 g，NiCl·6H2O0.0004 g，ZnSO4·7H2O0.0004 g，FeCl3·6H2O0.0002 g，NaMoO4·2H2O0.0002 g，pH值7.2蒸馏水1 000 mL。

2.3 生物乳化剂产生菌的富集和纯化

称取定量土样于液蜡培养基中进行富集。培养温度37℃，180r/min，摇床震荡培养，时间7 d，富集3～5次。将富集液进行稀释涂布，培养基采用LB培养基分离纯化。将分离得到的菌株进行分离纯化以备后期乳化性能的测定。

2.4 乳化性能的测定

将分离到的菌株接种到LB液体培养基中，37℃，180r/min摇床过夜培养。在试管中加入3 mL柴油作为测试烃和7mL培养液，涡旋振荡器充分振荡1 min，静止2 h，以乳化指数（EI24=乳化层高度/有机相总高度）[9，10]表示乳化剂的乳化活性。

2.5 菌株的鉴定

2.5.1 生理生化反应检测

参考常见细菌系统鉴定手册测定。

2.5.2 菌株16S rRNA鉴定

将筛选得到的菌株进行DNA的提取后，利用细菌16S rRNA基因通用引物27F和1492R来扩增16S rRNA基因序列。PCR反应体系的反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环，72℃延伸10 min[11]。扩增产物经电泳检测后送北京生物工程公司检测。序列用于系统发育树作图。

2.6 产生物乳化剂菌株最适生长条件分析

将分离得到的目的菌株接种到发酵培养基中，37℃，180 r/min摇床震荡过夜培养后测定其对柴油的乳化作用。将发酵培养基的初始pH值分别调为7、8、9、10、11、12，初始盐浓度调为0%～9%，接种目的菌株，37℃，180 r/min摇床震荡过夜培养后测定其乳化指数及在600 nm波长下的OD值，以未接菌的空白培养基作为对照[12]。

2.7 生物乳化剂的分离

将目的菌株进行发酵培养，发酵液经10 000 r/min离心10 min，除去菌体。上清液中缓慢加入（NH4）2SO4至75%饱和度，4℃冰箱过夜沉淀。9 000 r/min离心15 min除去上清，沉淀重溶于少量蒸馏水，经冷冻干燥后获得絮状固体即为乳化剂粗制品[13]。

2.8 生物乳化剂理化性质分析

（1）乳化剂的乳化浓度范围：将乳化剂样品溶于ddH2O中，分别稀释为5 mg/L、4.5 mg/L、4 mg/L、3.5 mg/L、3 mg/L、2.5 mg/L、2 mg/L、1.5 mg/L和1 mg/L，检测其乳化活性，测试乳化剂作用浓度范围。

（2）生物乳化剂的糖类组分的定性检测采用硫酸-蒽酮显色法，脂类组分的定性检测采用钼酸铵一高氯酸显色法，蛋白质组分的定性检测采用水合茚三酮显色法。根据苯酚-硫酸法、氯仿/甲醇法、考马斯亮蓝法对乳化剂中糖、脂和蛋白含量进行定量测试。

3 结果与分析

3.1 菌株的分离筛选

经过富集培养和分离纯化，从滨州地区石油开采区的石油污染土壤中分离获得4株菌，其中菌株SJ在发酵培养基中产乳化剂能力最强，乳化指数为100%（图1）。

3.2 菌株SJ的鉴定

菌株SJ在LB平板上的菌落呈圆形，边缘整齐，产色素，橘黄色。革兰氏染色呈阴性，菌体近球状，不产芽孢，无荚膜。生理生化检测表明，该菌株为兼性好氧菌，甲基红试验为阴性，不水解尿素，能利用柠檬酸盐，淀粉水解与纤维素水解为阴性，V-P试验为阴性。提取其基因组，并扩增16S rRNA基因，经测序得到1 500bp左右的基因序列，与NCBI中的序列进行比对发现该菌株与菌株Serratia sp. SCH-1（KJ584612.1）同源性最高（图2），序列相似性为99%，初步判定菌株SJ属于沙雷氏菌属，命名为Serratia sp. SJ。

3.3 SJ菌株的最适生长条件

测试了菌种SJ在不同的pH值条件下、不同NaCl浓度下的生长情况，结果发现菌株SJ在pH值7～12的范围内都能够生长，最适生长pH值为8.0；在NaCl浓度为0～4%的范围内生长良好（图3、图4）。

3.4 菌株SJ产生物乳化剂的发酵时间

在菌株SJ发酵培养的最适条件下进行发酵培养，每隔2 h，取菌液测定乳化指数，结果如图5所示，菌株生长22 h以后，发酵液的乳化指数达到100%。

3.5 菌株SJ产生的生物乳化剂的提取

发酵培养SJ菌株，将发酵液离心除去菌体，将上清用饱和（NH4）2SO4至进行沉淀，4℃冰箱过夜沉淀，9 000 r/min离心15 min除去上清，将沉淀透析后冷冻干燥。2L发酵液中提取出乳化剂1.5 g，得率为0.75 g/L。

将得到的生物乳化剂配制成不同浓度的样品，分别测试乳化能力，如图6所示，结果表明 乳化剂浓度大于2 mg/mL乳化指数均为100%，说明有效提取了菌株SJ产生的生物乳化剂。

3.6 菌株SJ产生的生物乳化剂的定性定量分析

对菌株SJ产生的生物乳化剂进行定性和定量分析，采用硫酸-蒽酮显色法检测发现，生物乳化剂样品和对照组（D-果糖）均呈现蓝绿色，表示该生物乳化剂中含有糖组分；水合茚三酮显色实验中，乳化剂样品呈现粉红色，表示该生物乳化剂中含有蛋白质成分；钼酸铵-高氯酸显色反应中发现样品和对照组（橄榄油）均呈现蓝黑色反应，表示该生物乳化剂中含有脂质成分。定量分析结果表明，三种组分的含量分别为34.7%、41.6%和16.0%。

4 结论

本实验从石油污染盐碱土中分离得到一株产生物乳化剂的菌株SJ，经鉴定该菌株属于沙雷氏菌。该菌株对pH值与盐度均有很强的耐受性，pH值耐受范围为7～10，NaCl的最适生长浓度范围为0～4%。采用盐沉法提取了菌种SJ发酵液中的生物乳化剂，得率为0.75 g/L，该乳化剂含有糖、蛋白和脂类三种成分，比例为34.7%、41.6%和16.0%。菌株SJ及其产生的生物乳化剂在石油污染土壤的生物治理、微生物采油等方面具有应用前景。

参考文献：

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[12]任华锋，张雨山，王 静，等.石油烃降解菌的分离鉴定及其产生乳化剂条件[J].化学工业与工程，2010，27（3）：189～194.

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