卫气虚模型大鼠血浆代谢标志物月节律变化的研究

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摘要：目的 运用代谢组学方法研究卫气虚证月周期性变化的物质基础，寻找其潜在标志物，为卫气虚证实质研究提供新的途径。方法 以秋分日所在的农历月，确定月初（农历八月初一）、月中（八月十五）及月末（八月三十）3次实验的取材时间。取材日前2周将20只大鼠随机分为正常组与模型组，每组10只。模型组采用疲劳联合寒热交替法制备卫气虚模型，正常组常规喂养。3次实验均在其相应取材日正午12：00断头取血，采用高效液相色谱-质谱联用仪检测血浆代谢物，利用偏最小二乘法对数据进行统计分析，组间进行比较，探索卫气虚证差异性代谢标志物，进而推测寻找卫气虚证月周期变化的潜在标志物。结果 油酸酰胺、磷脂酰甘油、皮质醇、脯氨酸、富马酸二甲酯、二十碳五烯酸6种差异代谢物可能为月初卫气虚证潜在证候标志物；1-磷酸鞘氨醇、苹果酸、皮质醇、油酸酰胺、肉毒碱、二十碳五烯酸、富马酸二甲酯7种差异代谢物可能为月中卫气虚证潜在证候标志物；胆固醇乙酸酯、苏氨酸、皮质醇、富马酸二甲酯、油酸酰胺、二十碳五烯酸、焦谷氨酸7种差异代谢物可能为月末卫气虚证潜在证候标志物。结论 卫气虚证月周期性变化可能受油酸酰胺、皮质醇、二十碳五烯酸、富马酸二甲酯影响，其周期性变化可能与能量代谢密切相关，同时还伴随着细胞、激素及神经调节。

关键词：卫气虚证；月节律；代谢组学；实验研究

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.012

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）11-0046-05

Abstract： Objective To use metabonomics method to study the change of the basic materials of month rhythm of wei qi deficiency syndrome； To find the potential markers so as to provides a new way for the essence of the wei qi deficiency syndrome research. Methods Based on the autumnal equinox in lunar calendar month， the beginning of a month （the first day of lunar August）， the middle of a month （the 15th day of lunar August）， and the end of a month （the 30th day of lunar August） were set as the three days to draw experimental materials. Two weeks before drawing materials， 20 rats were randomly divided into control group and model group， 10 rats in each group. The model rats were modeled by the stimulus of fatigue combined with coldness and hotness. Control group rats received conventional breeding. The rats in the both groups during the three experiments received decollation and the blood was taken at the 12 o’clock at noon. HPLC-MS was used to detect plasma metabolites， and partial least squares were used to make statistical analysis on the data for comparing plasma metabonomics original data of control group and model group. Possible metabolic markers of wei qi deficiency syndrome were explored， and the potential makers of month rhythm change of wei qi deficiency syndrome were deduced. Results Oleamide， phosphatidyl glycerol， cortisol， proline， dimethyl fumarate， and eicosapentaenoic acid may be potential markers of wei qi deficiency syndrome in the beginning of a month. Sphingosine-1-phosphate， malic acid， cortisol， oleamide， carnitine， eicosapentaenoic acid and dimethyl fumarate may be potential markers of wei qi deficiency syndrome in the middle of a month. Cholesteryl acetate， threonine， cortisol， dimethyl fumarate， oleamide， eicosapentaenoic acid and pyroglutamate may be potential markers of wei qi deficiency syndrome in the end of a month. Conclusion Month rhythm change of wei qi deficiency syndrome may be influenced by oleamide， cortisol， eicosapentaenoic acid， dimethyl fumarate， and aconitic acid， and may be closely related to energy metabolism， meanwhile accompanied by regulation of cell， hormone and nerves.

Key words： wei qi deficiency syndrome； month rhythm； metabonomics； experimental research

卫气虚证是临床常见证型，本课题组前期采用分子生物学、基因学等现代研究方法，从分子、细胞和整体层面对卫气虚证进行了深入研究[1-2]，在一定程度上揭示了卫气虚的本质，但均难以从整体层面多系统阐释其变化规律。代谢组学作为一种系统性和整体性的研究方法，可从整体上反映生物体的功能水平，能比较全面地揭示疾病发展过程中生物体系内发生的一系列生物化学变化[3]，而发现的差异性代谢标志物能够多靶点、多层面网络式反映机体内部变化，这与中医整体恒动观念相一致。因此，我们采用代谢组学方法研究卫气虚证的物质基础，并结合《素问·八正神明论篇》所言“月始生，则血气始精，卫气始行；月郭满，则血气实，肌肉坚；月郭空，则肌肉减，经络虚，卫气去，形独居”的卫气月节律循行特点采取动态检测的方式，观察卫气虚模型大鼠血浆代谢标志物的月周期性变化，以期为卫气虚证实质研究提供新的途径。

1 实验材料

1.1 动物

6周龄健康雄性SD大鼠60只，SPF级，体质量160～200 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于河北中医学院动物实验中心恒温、通风、安静的环境，自由进食饮水，每日更换垫料，定期给鼠笼消毒。

1.2 主要试剂与仪器

乙腈、甲醇，色谱级，美国Fisher Scientific公司；蒸馏水，屈臣氏；色谱柱，美国phenomenex公司；乙酸、乙酸铵，色谱级，中国Dikmapure公司。高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪（HPLC-MS），美国AB公司；液相系统，ekspertTM ultraLC100；质谱系统，AB Sciex QTRAP 4500，配有EI、离子肼；涡旋振荡器，QL-901，Vortex，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；液氮罐，YDS-10，河南新乡市新亚低温容器有限责任公司；MDF-382E型超低温保存箱，日本三洋公司；高速台式冷冻离心机，TGL-16M，湖南湘仪离心机仪器有限公司。

2 实验方法

2.1 分组及造模

以秋分日所在农历月，确定月初取材时间为2013年农历八月初一正午12：00、月中取材时间为2013年农历八月十五正午12：00、月末取材时间为2013年农历八月三十正午12：00。每次实验取材日前2周，将20只大鼠按随机数字表法分为正常组和模型组，每组10只，适应性喂养7 d后造模。其中月初正常组大鼠体质量为（173.89±8.61）g，模型组大鼠体质量为（181.96±9.21）g；月中正常组大鼠体质量为（179.64±10.09）g，模型组大鼠体质量为（184.09±10.65）g；月末正常组大鼠体质量为（180.16±7.95）g，模型组大鼠体质量为（177.65±7.86）g，各组大鼠体质量比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。正常组常规饲养，模型组给予疲劳联合寒热交替法造模[4-5]。模型组大鼠先在20 ℃左右常温水中游泳30 min，再取出，常规饲养，室温（25±1）℃，0.5 h后，将大鼠放入（40±1）℃恒温箱中15 min，再0.5 h后将大鼠放入-20 ℃冰柜中20 min进行寒冷刺激。以上过程每日1次，连续7 d。造模成功标准参考文献[4，6-7]制定：大鼠蜷缩、扎堆、怕冷、恶风；背毛凌乱、无光泽，汗出明显；喷嚏，有痰鸣音及鼻分泌物；反应迟钝，懒动。

2.2 样本采集与制备

取材前1 d开始禁食，24 h后大鼠断头处死，血液中加肝素钠20 μL，3500 r/min离心10 min，取上清液于冻存管中，液氮暂存，转-80 ℃冰箱保存。检测前血浆置4 ℃条件下复融。乙腈预冷提前在4 ℃条件下过夜。按100 μL血浆加300 μL乙腈比例沉淀蛋白，涡旋混匀，14 000 r/min离心10 min，取上清液，与水按1∶1稀释配比，14 000 r/min离心10 min。将上清液移入液相小瓶中备用待测。

2.3 代谢物检测

供试血浆样品用HPLC-MS检测。色谱条件：色谱柱为phenomenex Kinetex XB-C18（2.6 μm，100 mm×2.1 mm）；流动相：A为水（含0.05%乙酸，2 mmol/L乙酸铵溶液），B为乙腈（含0.05%乙酸，2 mmol/L乙酸铵溶液）；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃，进样量：5 μL。梯度洗脱条件设置见表1。质谱条件：正离子（ESI+）模式下进行检测，质谱检测数据采集范围：质荷比50～850 Da；Curtain Gas：30 psi，Gas1：55 psi，Gas2：55 psi；DP：60 V；EP：10 V；CE：5 eV；ISP：5500 V；Tem：500 ℃。

3 统计学方法

应用markerview1.2.1代谢组学分析软件进行峰识别、峰过滤、峰对齐，最终获得包括质荷比、保留时间及峰面积的二维数据阵。采用SIMCA13.0.3软件对数据进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA）[8]。将分析结果结合网上数据库检索鉴定可能的生物标志物。通过代谢组学分析软件行t检验，分析标志性代谢物的组间差异。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

采用PLS-DA的重要变量因子（阈值>1），并结合t检验P值（P<0.05）来寻找差异性表达代谢物。筛选确定候选代谢物后，搜索在线数据库进行检索，查找可能的代谢物，进一步缩小范围，分析推测代谢物。

4.1 月初卫气虚潜在标志物

在正离子模式下，经过PLS-DA，具有4个主成分，R2X=0.539，R2Y=0.994，Q2=0.86；PLS-DA得分图显示正常组与模型组被第一主成分完全分开，表明2组间有显著差异，见图1。模型组和正常组结果显示，预测能力Q2=0.86，53.9%X变量可用于解释2组间99.4%的差异Y。适合于解释2组间的代谢差异和发现2组间的差异性表达代谢物。结果在正离子模式下初步比对并推测出油酸酰胺、磷脂酰甘油、皮质醇、脯氨酸、富马酸二甲酯、二十碳五烯酸6种差异代谢物为月初卫气虚证潜在证候标志物，见表2。

4.2 月中卫气虚潜在标志物

在正离子模式下，经过PLS-DA，具有2个主成分，R2X=0.335，R2Y=0.999，Q2=0.968；PLS-DA得分图显示正常组与模型组被第一主成分完全分开，表明2组间有显著差异，见图2。模型组和正常组结果显示，预测能力Q2=0.968，33.5%的X变量可用于解释2组间99.9%的差异Y。适合于解释2组间的代谢差异和发现2组间的差异性表达代谢物。结果在正离子模式下初步比对并推测出1-磷酸鞘氨醇、苹果酸、皮质醇、油酸酰胺、肉毒碱、二十碳五烯酸、富马酸二甲酯7种差异代谢物为月中卫气虚证潜在证候标志物，见表3。

4.3 月末卫气虚潜在标志物

在正离子模式下，经过PLS-DA，具有2个主成分，R2X=0.202，R2Y=0.989，Q2=0.708；PLS-DA得分图显示正常组与模型组被第一主成分完全分开，表明2组间有显著差异，见图3。模型组和正常组结果显示预测能力Q2=0.708，20.2%的X变量可用于解释2组间98.9%的差异Y。适合于解释2组间的代谢差异和发现2组间的差异性表达代谢物。结果在正离子模式下初步比对并推测出胆固醇乙酸酯、苏氨酸、皮质醇、富马酸二甲酯、油酸酰胺、二十碳五烯酸、焦谷氨酸7种差异代谢物为月末卫气虚证潜在证候标志物，见表4。

4.4 卫气虚月周期差异性代谢物挖掘

依据月初、月中、月末3个时间点卫气虚潜在证候标志物，其中油酸酰胺、皮质醇、富马酸二甲酯、二十碳五烯酸4种差异性代谢物同时出现在3次实验中，推测这4种物质影响了卫气虚证月周期性变化。

5 讨论

卫气具有防御、调节、温煦等功能，如《灵枢·本藏》所言“卫气者，所以温分肉，充皮肤，肥腠理，司开合者也”。卫气虚证是卫气的功能减弱降低，其属于中医诊断学的一个基本证型，又名肺卫气虚不固证、肺虚表疏证，指肺气虚弱、卫表不固的证候。症见恶风、自汗、时常感冒、气短乏力、舌淡脉弱等。卫气虚证是机体在疾病发展过程中某个阶段的病理概括，能够反映疾病特定阶段病理变化的本质。每个证候都有其外在证象与内在本质，外在证象通过四诊所获信息辨证所得，而出现外在证象的根本在于内在本质，中医将其本质归结于五脏病变与气血阴阳失调。然而这种解释难以从现代医学角度阐释证的本质，中西医结合医学认为中医证的发生、发展必然有其相应的物质基础，这些物质决定了证候发生发展的动态变化[9]。有学者从免疫功能、神经调节、热代谢等方面阐述卫气与卫气虚的本质[10-11]，这些研究都从不同层面对卫气虚证本质做出解释，但忽略了整体观念。代谢组学具有整体性、系统性、综合性的特点，将生物体作为一个完整的系统研究，能够多靶点、多层面网络式反映机体内部整体性变化，故本研究采用代谢组学方法研究卫气虚证的物质基础。并结合《内经》所言的卫气月节律循行特点，采取与之相应的动态检测方式，观察卫气虚证代谢标志物的月周期变化。

本研究结果显示，油酸酰胺、磷脂酰甘油、皮质醇、脯氨酸、富马酸二甲酯、二十碳五烯酸、1-磷酸鞘氨醇、苹果酸、肉毒碱、胆固醇乙酸酯、苏氨酸、焦谷氨酸等差异代谢物可能为卫气虚证潜在证候标志物，其中油酸酰胺、皮质醇、富马酸二甲酯、二十碳五烯酸4种潜在证候标志物贯穿于卫气虚证月周期变化的始终。这些物质的变化涉及能量代谢，还包括了激素、细胞、神经调节。其中油酸酰胺最早发现于动物脑脊液中，能诱导动物产生生理性睡眠[12]，属内源性脂肪酰胺，具有生理及神经调节作用。研究表明，油酸酰胺对小鼠产生显著的镇静作用，并能拮抗中枢兴奋剂的动物兴奋作用，增加慢波睡眠[13]。此外，油酸酰胺对5-羟色胺能神经传递具有调节作用，表明其具有外周及中枢神经调节的功能。中医认为，卫气的昼夜循行与人体寤寐密切相关，油酸酰胺则可能是卫气调节人体寤寐的重要物质之一，同时也是卫气受神经调节的有利证明。二十碳五烯酸是n-3多不饱和脂肪酸，属必需长链不饱和脂肪酸，通过调节脂肪酸合成和β-氧化改善脂肪酸、三酰甘油代谢。同时具有抗肿瘤、降血糖、保护肾脏、改善胰岛素抵抗、防治心脑血管疾病的作用[14-15]。富马酸二甲酯能够调节细胞氧化还原系统[16]及免疫炎症[17]，被认为是具有无重大免疫抑制的免疫调节剂。皮质醇是一种糖皮质激素，可以调节糖、蛋白质以及脂肪的代谢，对维持血压稳定和控制机体的炎症反应有重要作用[18]。这3种物质均与免疫功能相关，对人体的能量代谢平衡，保护机体防治脏腑疾病有重要意义，这与卫气的卫外固护、温养脏腑的功能相一致。这些差异性代谢物质含量的变化势必影响到卫气的功能，当其失衡时则出现卫气功能下降，即卫气虚证的表现。这些代谢标志物的发现表明，卫气虚证的月周期性变化可能与能量代谢有关，同时还伴随着细胞、激素与神经调节，是机体整体多层面网络式的变化过程。

本研究首次应用代谢组学方法探讨卫气虚的物质基础，并结合卫气月节律采取与其相一致的动态检测方式，观察卫气虚证潜在标志物的月周期变化。以期为中医证候学提供客观依据，为卫气学说研究提供新的途径，揭示卫气及卫气虚的本质。由于动物实验的局限性，研究尚存在不足。课题组将在此基础上进行人体大样本研究，以期更为全面阐释卫气的实质。

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