代谢组学研究复方柴归方超临界CO2提取物抗抑郁作用及其机制

[摘要]采用小鼠悬尾试验（TST）、强迫游泳试验（FST）以及大鼠慢性温和不可预知应激（CUMS）模型评价复方柴归方超临界CO₂提取物（FFCGF）的抗抑郁作用；采用核磁共振代谢组学的方法，结合多元统计分析技术探讨FFCGF的抗抑郁作用机制。大鼠进行为期28 d的CUMS程序造模，药物干预28 d，与CUMS造模同时进行，造模过程中观察大鼠体重、糖水偏爱、穿越格数和直立次数的变化，造模结束后收集大鼠尿液，应用1H-NMR技术结合多元统计分析方法分析大鼠尿液内源性代谢产物的变化规律，寻找潜在的生物标志物。结果显示FFCGF能明显减少小鼠悬尾试验和强迫游泳试验的不动时间，改善CUMS模型大鼠的体重、糖水偏爱、穿越格数和直立次数，说明FFCGF具有明确的抗抑郁作用。代谢组学结果显示空白组和模型组能明显区分，CUMS模型大鼠尿液中甘氨酸和丙酮酸含量显著升高，醋酸、琥珀酸、2-氧化戊二酸和柠檬酸含量显著降低（P < 0.05，0.01），FFCGF能够明显调节CUMS程序引起的6种生物标志物的含量变化，使其恢复正常。FFCGF可能通过调节能量代谢、脂质代谢和氨基酸代谢发挥抗抑郁作用。

[关键词]复方柴归方超临界CO₂提取物；代谢组学；抑郁症；核磁共振

复方柴归方是本实验室在逍遥散的基础上，经过化学与药理研究获得的新配方，由柴胡、当归、白术、甘草（炙）、薄荷、生姜等6味药组成^[1-3]。代谢组学主要利用高分辨核磁共振或现代质谱技术，对生物体液的内源性代谢产物进行测定，结合模式识别等数值分析方法，研究生物体在生理、病理以及药物和毒物作用下发生的各种代谢物动态变化，进而确定与之相关的生物标志物^[4-6]。本研究主要采用小鼠TST， FST以及大鼠CUMS模型，结合代谢组学方法和多元统计分析技术，探讨复方柴归方超临界CO₂提取物的抗抑郁作用及其可能的作用机制。

1材料

1.1药品与试剂 复方柴归方组成为：柴胡30 g，当归30 g，白术30 g，炙甘草15 g，生姜10 g，薄荷10 g。以上药材均购自山西省华阳药业有限公司，经山西大学中医药现代研究中心秦雪梅教授鉴定为正品；复方柴归方和逍遥散超临界CO₂提取物由山西省林业科学院提供；盐酸文拉法辛胶囊（25 mg/粒，批号 120401），成都康弘药业集团股份有限公司；D₂O，美国默克试剂公司；金龙鱼食用油（天津市天津港保税区，产品标准Q/BAAK0012S）。

1.2给药样品超临界CO₂提取物制备 复方柴归方和逍遥散分别按处方量配比混合，粉碎，过20目筛，置于超临界萃取装置中，提取压力20 MPa，提取温度50 ℃，CO₂流量25 kg·h^-1，提取时间3 h，使用前将FFCGF和逍遥散超临界CO₂提取物保存于4 ℃冰箱中。

1.3动物 雄性 ICR小鼠，SPF级，动物许可证号SCXK（京）2011-0012，18～22 g；雄性SD大鼠，SPF级，动物许可证号SCXK（京）2011-0012，180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物自然昼夜节律光照，适应1周后进行实验。

1.4仪器 Bruker 600 MHz Avance Ⅲ NMR 谱仪，瑞士Bruker公司；Centrifuge TDL-5型离心机，上海安亭科学仪器厂；HA121-50-01型超临界CO₂流体萃取装置，南通华安超临界萃取有限公司；CO₂纯度99.0 %以上，食品级；自制大鼠旷场行为测试箱；动物行为视频分析系统观察箱；有机玻璃缸等。

2方法

2.1分组与给药 小鼠悬尾试验^[7]：雄性ICR小鼠适应1周后，随机分为5组，每组12只，分别为空白组，阳性组（盐酸文拉法辛，0.05 g·kg^-1），逍遥散超临界CO₂提取物组（逍遥散组，生药66 g·kg^-1）、复方柴归方超临界CO₂提取物高剂量组（复高组，生药92 g·kg^-1）、中剂量组（复中组，生药46 g·kg^-1）和低剂量组（复低组，生药23 g·kg^-1）。逍遥散和复方柴归方超临界CO₂提取物使用前用食用油稀释至相应浓度，盐酸文拉法辛用生理盐水稀释至相应浓度，各给药组灌胃给予相应药物20 mL·kg^-1·d^-1，空白组给予等量食用油，连续14 d。末次给药1 h后，将小鼠尾尖1 cm处黏贴于悬挂钩上，并且手托小鼠将其挂入动物行为视频分析系统观察箱中，记录6 min内小鼠行为，分析后4 min内小鼠的不动时间。

小鼠强迫游泳试验^[7]：动物分组及给药与小鼠悬尾实验相同。末次给药1 h后，用动物行为视频分析系统记录6 min内小鼠的游泳行为状况，分析后4 min内小鼠强迫游泳的不动时间。

CUMS模型复制、分组及给药：70只实验大鼠适应性饲养1周后，进行旷场适应和糖水偏爱训练，随机分为7组，每组10只，分别为空白组（食用油）、模型组（食用油）、阳性组（盐酸文拉法辛， 0.035 g·kg^-1）、逍遥散超临界CO₂提取物组（逍遥散组，生药46 g·kg^-1）、复方柴归方超临界CO₂提取物高剂量组（复高组，生药64 g·kg^-1）、中剂量组（复中组，生药32 g·kg^-1）和低剂量组（复低组，生药16 g·kg^-1），除空白组外，其余各组大鼠依照Willner等的方法并结合本实验室改进方法进行造模^[8-9]，刺激因子包括禁食24 h，禁水24 h，4 ℃冰水游泳5 min，45 ℃热应激5 min，夹尾2 min，足底电击5 min，超声刺激3 h。在CUMS造模同时给药，各给药组灌胃给予相应药物10 mL·kg^-1·d^-1，模型组和空白组灌胃给予等量食用油，给药1 h后给予以上刺激，每日1种，每种刺激随机实施3～4次，持续28 d。在实验第0，7，14，21，28 d分别测定大鼠的体重和糖水偏爱率，以及大鼠旷场试验中的穿越格数和直立次数。