雌雄异株药用植物的物质基础分析及其研究技术

关键词：雌雄异株；药用植物；物质基础；综述

中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）04-0104-04

雌雄异株植物系指雌花与雄花分别生长在不同植株体上的单性花种子植物。如杜仲、天花粉、山药等常用中药均来自于雌雄异株植物。古代本草文献和现代临床应用虽然没有严格区分中药材的雌雄来源，但也有一些中药就局限于雌或雄性的植物部位。如杨枸花只是毛白杨的雄性花序[1]，一般在使用天花粉时也希望使用块更大、粉更多的雄性栝楼的块根。因此，雌雄异株植物的雌、雄株在物质基础和药效方面应该是有一定区别的。已有的研究表明，雌雄异株药用植物在生理生化以及某些活性成分的含量上的确是有显著差异的。如作为甾体激素类主要药源植物的盾叶薯蓣Dioscorea zingiberensis C.H. Wright雄株根状茎中薯蓣皂苷元的含量就高于雌株[2]。另外，白果、五味子、罗汉果、瓜蒌、瓜蒌子、楮实子、榧子等都是来源于雌雄异株植物雌株的果实或种子。为此，我们对近40年来有关雌雄异株药用植物雌、雄株存在的物质基础的差别，以及相应的鉴别分析技术作一综述。

1 外观性状上的区别

雌雄异株植物在外观性状上存在明显差别，这是雌雄异株植物的基本区别。如毛白杨Populus tomentosa Carr.的雄花芽于上一年秋天形成，春天开始萌发，经10～15 d形成柔荑花序，外被红褐色鳞片，花穗开放后直接脱落，不形成飘絮现象；而毛白杨雌株的花穗则在春天不脱落，当发育、生长到10～16 cm时，鳞片逐渐脱落，果穗由红褐色变为鲜绿色，蒴果成熟后裂开，吐放出大量的带有一丛绵毛的种子，从而形成漫天飘絮的现象[1，3]。

2 化学成分及其含量差异

2.1 氨基酸

雌雄株杜仲Eucommia ulmoides Oliv.树皮和叶片中氨基酸含量的分析表明，雌、雄株树皮中必需氨基酸的总含量分别为1.135%和1.066%，雌、雄株叶片中必需氨基酸的总含量分别为6.675%和6.543%，体现在此两个部位中必需氨基酸含量为雌株高于雄株。雌雄株间差异最大的是胱氨酸，在雌、雄株树皮中的含量分别为0.080 8、0.143 0 mg/100 mg，雌株中的含量是雄株的56.50%；在雌、雄株叶片中的含量分别为0.050 4、0.073 1 mg/100 mg，雌株中的含量是雄株的68.95%[4]。

银杏Ginkgo biloba L.不同性别叶片中17种氨基酸的分析结果表明，各种氨基酸的平均含量（同性别植株均取3株）均表现为雄株高于雌株。雌、雄株平均总含量分别为287.38、316.07 μg/mg干重，雌株中的含量是雄株的90.92%。雄株高出雌株含量10%以上的有8种氨基酸，其中差异最大的为酪氨酸和胱氨酸，雌、雄株中酪氨酸的平均含量分别为10.43、14.70 μg/mg干重，雄株比雌株高40.94%，雌、雄株中胱氨酸的平均含量分别为1.31、1.68 μg/mg干重，雄株比雌株高28.24%[5]。

2.2 皂苷

研究表明，盾叶薯蓣的根状茎中薯蓣皂苷元的含量与性别的相关性明显，雄株根状茎中的含量比雌株高2.04%[2]。

2.3 甲醇提取物

高效液相色谱法（HPLC）对栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim.雌雄植株叶片80%甲醇提取物进行的分析结果显示，在相同色谱条件下，雌雄植株样品的出峰时间、出峰数目、峰高等均存在差异，其中出峰时间的差异最为显著，雌株样品在27～37 min的保留时间内出现了一些峰高明显高于雄株的峰。雄株样品在10～22 min出现了大量峰高明显高于雌株的峰。说明雌雄植株所含的化学物质组成及含量存在较大的差别[6]。

2.4 紫外吸收物

栝楼植株叶片的紫外吸收物主要是酚类物质，如类黄酮、黄酮醇、花色素苷及一些烯萜类化合物，类黄酮是其中最主要的组分。栝楼雌、雄叶片中紫外吸收物的量分别为0.133、0.126，雌株中的量高于雄株，差异有统计学意义。紫外吸收物的含量可作为鉴定栝楼植株性别的有效指标[6]。

3 生理指标差异

雌雄异株植物是陆地生态系统的重要组分，自然种群中雌雄个体的性别比例通常为1∶1，但随水分、养分、CO2浓度、温度、光照和干扰水平等的不同而有所不同。一般来说，在逆境下性别比例偏雄性[7]。

3.1 光合色素的含量

光合色素的含量是反映植物光合能力的一项重要指标，一般情况下，植株光合色素的量高则光合能力强，植株生长旺盛，生物量高。栝楼雄株叶片中叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素、总叶绿素等光合色素的量高于雌株叶片，且差异有统计学意义。田间观察发现，栝楼雄株一般比雌株强壮，该现象可能与雄株光合色素的含量较高有关[6]。

3.2 磷酸腺苷的含量

ATP、ADP、AMP组成的腺苷酸系统是细胞内最重要能量转换与调节系统。银杏中ATP的含量，雄株为21.38×10-2 μmol/mg FW（鲜重），高于雌株的20.57×10-2 μmol/mg FW；ADP的含量，雄株为19.32×10-2 μmol/mg FW，高于雌株的16.52×10-2 μmol/mg FW；AMP的含量，雄株为26.93×10-2 μmol/mg FW，低于雌株的28.33×10-2 μmol/mg FW[8]。

3.3 气孔导度和蒸腾速率

对银杏雌雄株全天24 h的树干液流、气孔导度、蒸腾速率和水分利用效率进行的对比研究发现，雌株的平均液流速率是1.052 24 g H2O/（m2·s），略小于雄株的1.0559 g H2O/（m2·s）；雌株的平均气孔导度是0.0472 mol H2O/（m2·s），大于雄株0.038 2 mol H2O/（m2·s）；雌株平均蒸腾速率是5.17 mmol/（m2·s），略大于雄株的5.01 mmol/（m2·s）[9]。

3.4 内源激素的含量

国内外许多研究已表明，内源激素的含量和（或）比率与性别分化存在一定的联系[10-11]。

在植物激素中，赤霉素对植物性别的改变起着举足轻重的作用，可控制植物的性别表达。绞股蓝Gynostemma pentaphyllum （Thunb.） Makino雌雄株茎尖赤霉素GA1+3的含量的比率在苗期、生长旺期和营养生长后期分别为1∶7、1∶17和1∶6。这表明绞股蓝茎尖端较高的GA1+3含量与雄株的分化有关[12]。这与荔枝花Lychee flos中GA1+3含量的降低伴随着雄性器官分化的结果恰恰相反[13]。可见，赤霉素含量对不同植物性别分化的影响是不同的。

细胞分裂素（iPAs）刺激蛋白质和核酸的合成，最显著的特点是促进细胞的分裂。绞股蓝雌株茎端的iPAs含量明显低于雄株。雌、雄植株茎端在苗期、生长旺盛和营养生长后期iPAs含量的比值分别为1∶6.7、1∶50和1∶8.3[12]。银杏雌、雄株实生树内源激素在生长季节的变化研究发现，雌株叶片中玉米素（ZT）的含量较雄株高90.91%，吲哚乙酸（IAA）和脱落酸（ABA）则相反，雄株较雌株分别高出12.34%和1.0倍[14]。

研究显示，雌雄异株植物中，雄株特异性的RNAs依赖于高的内源激素浓度，雌株特异性的RNAs依赖于活跃的iPAs[15]。但是，对雌雄异株植物内源激素在性别表达过程中的变化及可能的作用机制的研究目前还较少。

4 同工酶谱的差异

同工酶是性别分化基因和其mRNA在蛋白质水平上的体现，不同的性别具有不同的同工酶谱，利用同工酶谱的不同则可为植物的性别鉴定提供可靠的科学依据[8，16]。

4.1 过氧化物酶同工酶

对华中五味子Schisandra sphenanthera Rehd.& Wils雌雄株不同时期、不同器官的过氧化物酶（POD）同工酶进行的分析发现，芽和茎具有时间特异性，不同时期的功能叶则趋于稳定。雌株功能叶有5条酶带，雄株功能叶只有2条酶带，酶谱差异明显。同时，不同生境下雌雄株酶谱表现一致。表明利用POD同工酶分析鉴别华中五味子雌雄株是可行的[17]。

通过对构树Broussonetia Papyrifera Vent雌雄株POD同工酶谱比较分析发现，雌株有7条酶带，雄株有5条。在迁移率为0.56～0.59的区域，雌株有1条酶带（Rf0.58），雄株有2条（Rf0.56、Rf0.59）；在迁移率为0.61～0.65的区域，雌株有3条酶带，而雄株没有酶带。另外，雌株的酶活性明显高于雄株[18]。

以银杏优良品种“佛手”为材料进行的POD同工酶谱分析结果表明，雄株有3条谱带，雌株有5条谱带，其中谱带P2和P5为雌株特有[8]。

罗汉果Siraidia grosvenorii （Swingle） C.Jeffry叶中的POD同工酶的含量是各部位中最高的，活力也最强，雄株的特异酶带是P5和P11，雌株的特异酶带是P1、P6、P7、P9、P10，雌株酶带的整体活力较雄株强[19]。

4.2 酯酶同工酶

对雌雄株罗汉果叶进行的分析结果显示，酯酶（EST）同工酶E4为雄株的特异带，E10是雌株的特异带[19]。

4.3 超氧化物歧化酶同工酶

对雌雄株罗汉果叶超氧化物歧化酶（SOD）同工酶的比较发现，S1、S2和S6是雌株特有的3条谱带[19]。

4.4 多酚氧化酶同工酶

对雌雄株罗汉果叶多酚氧化酶（PPO）同工酶进行的比较显示，雄株仅有2条酶带，而雌株比雄株多出5条酶带[19]。

4.5 过氧化氢酶同工酶

雌雄株罗汉果叶过氧化氢酶（CAT）同工酶存在明显的差别，雄株仅有C3和C4带，其中C3为雄株特有，而雌株的特异带为C1和C2[19]。

5 化学试剂反应

银杏雌雄株可采用溴麝香草酚蓝（BTB）法鉴别。称取样品叶1 g，剪碎，置入试管内，加入0.1%溴麝香草酚蓝液5 mL，在20～25 ℃下，观察颜色变化所需时间。若为雄株，溶液3 min后呈墨绿色，5～7 min后呈绿色，10～12 min后为黄绿色，18～22 min即呈黄橙色；若为雌株，溶液的颜色转化到黄橙色需要2～5 h。该试剂快速显示黄橙色，表明雄株的银杏叶片液汁的酸性较强，说明其酸性物质的强度较高，而雌株叶片酸性物质的强度较低[20]。

绞股蓝雌雄株幼苗的叶片提取液，经BTB处理，其颜色随着时间的延长逐渐发生变化，经过10 h后，雌株的提取液为黄色，而雄株的提取液为绿色，这种现象说明雌株的酸性比雄株要强[12]。

6 分子生物学研究

6.1 扩增片段长度多态分析

利用建立的扩增片段长度多态分析（AFLP）体系及T-A克隆测序对榧树Torreya grandis Fort苗期雌雄株进行鉴别，从15对引物中用E-AGC/M-CAT得到了1条雌株特异的条带，而雄株中没有[21]。在对罗汉果幼苗进行AFLP标记分析时，从9对引物中筛选出ATG/CAT引物对进行扩增，在DNA条带长度为280 bp和190 bp处的谱带为雄株特有[22]。利用27个引物组合对雌雄银杏2个DNA池进行AFLP分析，共扩增出1896条带，其中有3个引物组合E2/M5、E4/M4、E5/M3的3个标记只存在于雌性基因池中，经Southern点杂交证实，E2/M5、E5/M3两个标记为银杏雌株基因组所特有[23]。

6.2 随机扩增多态性DNA和特征序列扩增区域分子标记

采用21个随机引物对75份罗汉果雌雄株样品进行随机扩增多态性DNA（RAPD）分析，得到92个多态性位点。用POPGENE软件统计主要栽培品种雌、雄株的多态位点百分率和Shannon信息多样性指数，根据样品间的Dice相似性系数，分别对雌、雄株进行主成分分析。结果表明，主要的雌株栽培品种遗传多样性很低，而雄株遗传多样性较高[24]。采用RAPD技术研究与罗汉果性别连锁的分子标记，利用雌雄个体对从90条随机引物中筛选出的可能与性别连锁的18条RAPD标记进行验证，发现引物S1431扩增的约400 bp多态性谱带是一条与雄性连锁的RAPD标记，在雌性单株中不出现[25]。

在对香榧幼苗早期性别鉴定的研究中，利用RAPD随机引物S250扩增得到了1条约600 bp的雄性特异性片段S250-600。对该RAPD标记片段进行回收、克隆和测序，获得了593 bp的该标记的核苷酸特定序列。根据对该片段的序列分析结果，设计了1对引物，成功地将RAPD标记转化为在雄性个体中均能稳定出现的特征序列扩增区域（SCAR）标记。该标记可用来对香榧品种进行大规模的性别鉴定[26]。在利用RAPD标记技术鉴定番木瓜Caric papaya L.雄性性状时，从214条10碱基随机引物中，用引物Z18扩增得到一条雄株特有的多态性片段Z18-1000，根据对该片段的序列分析结果重新设计了2对引物，将RAPD标记成功转化为雄株特有SCAR标记SD-1000。运用此标记在34株已知性别的番木瓜植株上进行验证，表明可以从早期幼苗中鉴定出雄株番木瓜[27]。国外学者通过研究RAPD标记，转化得到的SCAR T12和SCAR W11标记为番木瓜雄株和两性株特有，可快速、精确地用于鉴定性别[28-29]。

6.3 荧光原位杂交分析

以核糖体基因45S rDNA为探针，对雌雄株银杏中期、间期细胞进行荧光原位杂交（FISH），确定核糖体基因的位点数，结果显示，银杏的雌雄性别与随体染色体的数量有关。间期细胞核中的杂交点结果显示，核糖体基因的杂交点数有极显著差异（F=97.32），雌株银杏有4条带随体的染色体，而雄株只有3条[30]。

6.4 微卫星间隔标记分析

应用微卫星间隔标记分析（ISSR）分子标记对62份雌株和13份雄株栽培罗汉果样品进行了遗传多样性分析，用13条ISSR引物进行扩增得到64条多态性扩增带。在计算了样品间的相似性系数，并对雌雄株做主成分分析后，用UPGMA法进行聚类分析。结果表明，少数形态差异较大的样品具有较大的遗传差异，主要的雌株栽培品种遗传多样性很低；雄株的平均相似性系数较低，只有0.877，聚类分析也未能聚到一起，说明雄株之间存在较大的遗传多样性[31]。

6.5 核酸含量分析

银杏花芽分化之前，雄株核酸含量超出雌株15%左右；进入花芽形态分化期后，雌株则超出雄株15%左右，在此阶段雄株RNA/DNA比值上升4.04，而雌株上升了4.62，反映了雌、雄株在DNA复制和RNA转录水平的差异[14]。

6.6 蛋白质分析

对不同发育时期栝楼雌雄株的花器官进行的可溶性蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，雄株幼花芽中存在一种23.4 kD的特异蛋白质，而且雄株中一些蛋白（27.5、30.9、38.9、43.6 kD）的表达量明显高于雌株；雄花中一个分子量32.3 kD的蛋白条带在受精后消失[32]。

7 小结

随着科学的发展，学科间的相互渗透，植物化学、分子生物学分析技术已逐渐运用到植物性别差异的研究中，并发挥了不可替代的作用。分子生物学技术从遗传学的角度，对植物性别决定基因和性别决定机制进行分析，提高了分析结果的可靠性。以植物所含化学物质为基础的分析法作为一种比较植物性别的方法，以分析化学技术为依托，具有较高的科学性和可信度，而且技术先进、成熟，费用低廉，一般的技术人员都能操作，值得推广。基于多种分析方法都认为雌雄异株植物具有不同的性别表现特征，研究雌雄异株植物不同的化学成分及不等的化学成分含量，将对提升药用植物的药效活性具有一定的意义。研究具有性别决定意义的化学成分，对改变雌雄异株植物的生理活性也将具有一定的意义。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：人民卫生出版社，1977：287.

[2] 曹玉芳，王太霞，胡正海.盾叶薯蓣根状茎不同部位和不同生长期薯蓣皂苷元含量的差异性研究[J].中草药，2004，35（5）：562-565.

[3] 魏文波，梁子山，马妍，等.毛白杨飘絮调查[J].山东林业科技，2002， 32（2）：26-27.

[4] 赵云云，田汝岑，刘捷平.杜仲雌雄株树皮和叶片中氨基酸及其含量的研究[J].氨基酸和生物资源，1996，18（2）：5.

[5] 赵云云，田汝岑，刘捷平.银杏雌雄株叶片氨基酸组分及其含量[J].氨基酸杂志，1993，15（3）：9-11.

[6] 李珊，程舟，李彦，等.雌雄栝楼植株内含物比较研究[J].中草药，2008， 39（2）：260-263.

[7] 尹春英，李春阳.雌雄异株植物与性别比例有关的性别差异研究现状与展望[J].应用与环境生物学报，2007，13（3）：419-425.

[8] 温银元，戾铁梅，王玉国，等.银杏雌雄株间多种同工酶和磷酸腺苷含量的差异[J].山西农业科学，2008，36（6）：84-85.

[9] 曹全，江洪，曾波，等.孑遗植物银杏（Ginkgo biloba L.）雌雄株水分生理特征初步研究[J].安徽农业科学，2009，37（18）：8732-8735.

[10] Olff H， Kuiper D， Van Damme JMM， et al. Gynodioecy in Plantago lanceolata.VI.Functions of cytokinins in growth，development，and reproduction of two sex types[J]. Canadian Journal of Botany，1989， 67（9）：2765-2769.

[11] Ombrello TM， Garrison SA. Endogenous gibberellins and cytokinins in spear tips of Asparagus officinalis in relation to sex expression[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science，1987，112（3）：539-544.

[12] 王庆亚，郭巧生，孙建云，等.绞股蓝雌雄株的识别及内源激素变化的研究[J].中国中药杂志，2004，29（9）：837-840.

[13] Luo H， Zheng Z， Lin S， et al. Changes in endogenous hormones and polyamine during sexual differentiation of lychee flower[J]. Acta Horticulturae，2005，665：203-205.

[14] 王白坡，程晓建，戴文圣，等.银杏雌雄株内源激素和核酸的变化[J]. 浙江林学院学报，1999，16（2）：114-118.

[15] Delaigue M， Poulain T， Durand B. Phytohormone control of translatable RNA populations in sexual organogenesis of the dioecious plant Mercurialis annua L.（2n=16）[J]. Plant Molecular Biology，1984，3（6）：419-429.

[16] Corduan G. Isoenzyme variation as an indicator for the generative or somatic origin of anther-derived plants of Digitalis purpurea L.[J]. Zeitschrift fuer Pflanzenzuechtung， 1976，76（1）：47-55.

[17] 袁仕禄，贾卫国，战景仁，等.华中五味子雌雄株过氧化物酶同工酶性别鉴定研究[J].东北农业大学学报，1999，30（2）：195-198.

[18] 赵云云，田汝岭，刘捷平，等.雌雄构树过氧化物同工酶的比较研究[J].首都师范大学学报：自然科学版，1996，17（2）：84-87.

[19] 李惠敏，黄夕洋，高成伟，等.罗汉果雌雄株同工酶性别鉴定研究[J].广西植物，2007，27（5）：792-795.

[20] 卓国庆，刘长林，陈盛昴，等.银杏雌雄株早期鉴别及人工授粉技术[J].现代农业科技，2008，37（21）：121.

[21] 梁丹，周秦，殳燕，等.利用AFLP进行榧树雌雄株鉴定的初步研究[J].浙江林学院学报，2009，26（1）：63-67.

[22] 陶莉，王跃进，尤敏，等.AFLP用于构建罗汉果DNA指纹图谱及其幼苗雌雄鉴别[J].武汉植物学研究，2005，23（1）：77-80.

[23] 王晓梅，宋文芹，刘松，等.利用AFLP技术筛选与银杏性别相关的分子标记[J].南开大学学报：自然科学版，2001，34（1）：5-9.

[24] 周俊亚，唐绍清.栽培罗汉果遗传多样性的RAPD分析[J].分子植物育种，2006，4（1）：71-78.

[25] 韦弟，杨美纯，陈廷速，等.罗汉果性别的RAPD标记研究[J].中药材， 2006，29（4）：311-313.

[26] 戴正，陈力耕，童品璋.香榧性别鉴定的RAPD和SCAR标记[J].果树学报，2008，25（6）：856-859.

[27] 任朝兴，黄建昌，肖艳，等.番木瓜雄性性别的RAPD和SCAR标记[J].果树学报，2007，24（1）：72-75.

[28] Deputy JC， Ming R， Ma H， et al. Molecular markers for sex determination in papaya （Carica papaya L.）[J]. Theoretical and Applied Genetics，2002，106（1）：107-111.

[29] Urasaki N， Tokumoto M， Tarora K， et al. A male and hermaphrodite specific RAPD marker for papaya （Carica papaya L.）[J]. Theoretical and Applied Genetics，2002，104（2/3）：281.

[30] 张扬，朱胜男，金晓芬，等.45SrDNA-FISH鉴定银杏雌雄性别[J].园艺学报，2007，34（6）：1520-1524.

[31] 周俊亚，唐绍清，向悟生，等.栽培罗汉果遗传多样性的ISSR分析[J].广西植物，2005，25（5）：431-436.

[32] 于凤池，孙耘子，袁高峰，等.栝楼性别分化特异大分子标记物研究[J].浙江农业学报，2003，15（6）：332-335.

（收稿日期：2011-05-12，编辑：梅智胜）