基于核酸外切酶I的适配体荧光传感器检测人尿液中的Hg2+

打开文本图片集

摘 要 基于富含胸腺嘧啶（T）DNA适配体对Hg2+的特异性识别和核酸外切酶I（Exo Ⅰ）辅助的信号转换策略，建立了快速检测人尿液中Hg2+的荧光分析方法。固定在微孔板上的DNA适配体特异识别Hg2+后，折叠成稳定的发卡型双链结构，不能被单链特异性的Exo Ⅰ水解，核酸染料SYBR Green I（SG）插入发卡部位产生荧光信号，基于此可实现Hg2+的定量检测。优化后的最佳实验条件为：微孔板包被亲和素浓度为50 mg/L；检测DNA包被浓度为75 nmol/L；使用5 SG以及1.2 μL的Exo Ⅰ。在最佳实验条件下，体系荧光强度与Hg2+浓度的对数呈良好线性关系，线性范围为2～500 nmol/L，检出限为1.5 nmol/L（3σ）。利用本方法检测尿样中的Hg2+，加标回收率为91.2%～95.0%，相对标准偏差（n=5）为2.1%～4.6%。本方法选择性良好，操作简单，用HNO3KMnO4溶液将尿液中其它形式的汞氧化为Hg2+后，成功实现了尿液中总汞含量的检测。

关键词 DNA识别；核酸外切酶I；汞离子；信号放大；荧光分析

20160112收稿；20160424接受

本文系国家自然科学基金（No.21506087）资助

Email： flyzhql@iccas.ac.cn

1 引 言

汞是一种高毒性重金属元素，可在水、空气和土壤中进行迁移，并通过食物链进入人体，在肝、肾、脑等器官组织富集，影响生殖和发育，有致畸、致癌、致突变的作用[1，2]。目前，生物样品中总汞的检测方法主要有原子吸收光谱[3，4]、原子荧光光谱[5，6]和电感耦合等离子体质谱[7，8]等，这些方法灵敏度和分辨率高，但依赖于大型仪器和专业的操作人员，样品预处理繁琐，无法满足大批量样本快速筛查的需求[9，10]。因此，开发准确、灵敏、简便、快速、经济的汞检测新技术具有非常重要的实用价值。

Hg2+能进入DNA链的胸腺嘧啶（Thymine，T）碱基之间，形成稳定的 “THg2+T”结构，基于此人们构建了各种高灵敏、高特异性的Hg2+荧光传感器[11～13]。与传统的仪器分析方法比较，核酸作为识别分子的荧光传感方法简便、快速、成本低，尤其适于现场实时检测。但仍然存在检测通量低、假信号率高、难以直接应用于复杂生物试样[14]等不足。

核酸外切酶I（Exo Ⅰ）是按3′→5′方向，特异性切割单链的核酸外切酶，对双链DNA及RNA不起作用。许多研究将Exo Ⅰ应用于核酸探针的信号转变策略，以实现核酸、蛋白质等生物分子的超灵敏检测[15]。本研究在微孔板上固定DNA以识别目标分子，采用Exo Ⅰ辅助的信号转换策略，建立了快速检测尿液中Hg2+的高通量荧光分析新方法。Exo Ⅰ的使用降低了假信号率，提高了检测的灵敏度。将DNA进行固定后，识别和检测步骤分开进行，有效排除了样品基质中背景荧光物质的干扰，实现了复杂尿样中Hg2+的荧光分析检测。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

SpectraMaxParadigm多功能酶标仪（美国Molecular Devices 公司）；Fluoro log 321型荧光分光光度计（美国Jobin Yvon 公司）；UV2550 紫外分光光度计（日本岛津公司）；台式冷冻恒温摇床（太仓市实验设备厂）； PHS3C型pH 计（上海雷磁仪器厂）；迷你离心机（德国Eppendorf公司）。

黑色96孔微孔板（康宁公司）；亲和素和牛血清白蛋白（BSA，美国 Sigma 公司）；核酸外切酶I（E. coli Exo Ⅰ，2650A，大连宝生物工程有限公司）；检测DNA 序列（5′BiotinGGAGTTGGTTGATTGATTTTTTCTTTCTTCCTTCT 3′）由上海生工生物工程公司合成，用超纯水配成100 μmol/L储备液。实验所用的缓冲溶液（碳酸盐缓冲液：0.5 mol/L Na2CO3NaHCO3，pH=9.0；PBS缓冲液：0.1 mol/L Na2HPO4KH2PO4，100 mmol/L NaCl，pH=7.4；PBST缓冲液：0.1 mol/L PBS，pH=7.4， 2 mmol/L MgCl2，0.12% Tween20；结合缓冲液：25 mmol/L TrisHCl，pH=7.4，100 mmol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，5 mmol/L KCl）；SYBR Green I（10000×，DMSO）购自美国Invitrogen 公司，使用前用结合缓冲液稀释100倍（100×工作液）；0.5 mmol/L汞标准溶液的配制参见文献[16]，用结合缓冲液稀释成不同浓度。用经酸处理的具塞聚乙烯塑料瓶收集一次尿样，尽快测定比重，置于4℃保存；其它试剂为分析纯。实验用水为MilliQ超纯水（18.2 MΩ·cm，美国Millipore公司）。

2.2 实验方法

2.2.1 包被亲和素 亲和素用碳酸盐缓冲液稀释成适当浓度，包被微孔板（100 μL/孔），4℃放置12 h后， 用PBST缓冲溶液清洗。最后用1% BSA 封闭1 h，PBST洗涤3次。

2.2.2 DNA在微孔板上的固定 亲和素包被的微孔板中，每孔加入100 μL 检测DNA的PBS溶液， 37℃摇床摇振反应2 h，通过DNA 5′端的生物素和亲和素的特异相互作用，DNA固定到亲和素包被的微孔板上。PBST洗涤3次，200 μL/孔。然后加1% BSA封闭1 h，PBST洗涤3次。包被的DNA微孔板立即用于下步测试。

2.2.3 Hg2+的定量检测 （1）DNA识别反应 Hg2+标准溶液用结合缓冲液稀释成系列浓度，分别加入到包被检测DNA的微孔板中， 每孔100 μL，室温孵育40 min使DNA和Hg2+充分反应。接着在每孔中加入1.2 μL Exo Ⅰ（5 U/μL）和11 μL 10×Exo Ⅰ缓冲液， 37℃孵育30 min；倾去反应液，用PBST缓冲液洗涤3次，200 μL/孔。 （2）荧光测定 在识别反应后的微孔板各孔中加入100 μL 的5×SG的溶液，室温孵育10 min。用荧光酶标仪测定荧光光谱。激发波长480 nm，发射波长520 nm。加入Hg2+前， 测得荧光强度I0；加入Hg2+之后， 测得荧光强度IF，以IF定量分析Hg2+浓度，绘制工作曲线。

2.2.4 实际样品测定 （1） 添加回收实验 4℃保存的尿样，离心取上层清夜，向样品中分别添加2.0， 10.0和50.0 nmol/L的Hg2+标准液，4℃放置过夜后，再次离心，取上层清夜。用建立的方法测定荧光强度。（2）病人尿样总汞检测 先将尿样中其它形式的汞转变成Hg2+：在10 mL尿液中，加入浓HNO3 2 mL及 6% KMnO4溶液1 mL，加热回流2 h；待KMnO4溶液的颜色消失，将温度降低到60℃以下，然后加入0.1 mL KMnO4溶液，再加热溶液；最后用碱将溶液调至pH 8.0，并浓缩至原体积[17]。然后按照建立的方法检测。

3 实验部分

3.1 实验原理及可行性分析

实验原理如图1 所示，黑色微孔板固定的5′生物素标记的检测DNA序列含有较多的胸腺嘧啶（T）碱基，基于Hg2+能插入TT碱基之间形成稳定的（THg2+T）配位结构，检测DNA能对Hg2+进行特异识别。当Hg2+存在时，DNA结合Hg2+后发生构象转换，形成稳定的“发卡型”双链结构（图1中DNAHg）。Exo Ⅰ是单链特异性3′→5′ 核酸外切酶，不分解双链DNA。本研究中DNA转变成稳定的“发卡型”双链结构，Exo Ⅰ不能水解此双链结构[17]。核酸染料SG插入“发卡型”双链结构，产生荧光信号。相反，无Hg2+存在时，微孔板上固定的DNA被Exo Ⅰ剪切，因此无荧光信号发射。本研究采用微孔板固定DNA，Hg2+和DNA作用后也被固定在板上，识别反应结束后，液相与固相分离后，再加入SG测定荧光强度，尿样中复杂的基底及荧光成分[18]对检测信号基本不产生影响。

为验证方法的可行性，采用DNA溶液进行上述的识别反应，传感体系与Hg2+反应前后的荧光光谱图如图2所示。与Hg2+作用前，体系荧光信号较弱（图2，曲线1和2）；加入Hg2+后，体系的荧光信号强度大幅增加（图2，曲线3和4）。溶液中自由状态的DNA呈现松散的“茎环”结构，SG可以插入其中，显示一定荧光信号（图2，曲线2）；自由状态的DNA可被Exo Ⅰ水解，因此溶液基本上没有荧光信号（图2，曲线1），这说明使用Exo Ⅰ可以消除背景信号。曲线4的荧光信号弱于曲线3，说明Exo Ⅰ的加入使部分未反应的DNA被剪切，部分消除空白背景信号。上述实验结果说明，Exo Ⅰ的引入，特异性地消除了背景荧光信号，提高了分析的灵敏度。

3.2 实验条件的优化

3.2.1 亲和素包被浓度的优化 对亲和素的包被浓度进行了优化，测定了不同亲和素包被浓度下， 包被前后溶液在280 nm处吸光度值减少值ΔA（图3）。结果表明， 在亲和素包被浓度为50 mg/L时， 吸光度值减少量最大， 表明此时微孔板上包被亲和素的量达到饱和。所以本实验中采用50 mg/L亲和素进行包被。

3.2.2 DNA 的包被浓度的优化

固定亲和素包被浓度为50 mg/L，使用不同浓度的DNA包被微孔板后（无封闭步骤），然后与过量的Hg2+发生识别反应，形成“发卡型”双链结构后，加入过量的SG核酸染料孵育10 min，测定520 nm处的荧光强度 IF。结果如图4所示，在DNA包被浓度为75 nmol/L时，IF最大，表明此时包被的DNA最多。因此在本实验中，DNA包被浓度采用75 nmol/L。

3.2.3 SG用量的优化 固定亲和素包被浓度为50 mg/L，DNA包被浓度为75 nmol/L，与过量的Hg2+发生识别反应，形成“发卡型”双链结构后，分别与1×，5×，10×，20×的SG核酸染料孵育10 min，测定荧光强度。结果如图5所示，使用5×SG时，体系在520 nm波长处荧光强度达到最大值，说明此时反应已饱和，因此本实验中采用5×SG。

3.2.4 Exo Ⅰ用量的优化 当DNA包被浓度为75 nmol/L，封闭液为 1% BSA 时，DNA未做识别反应，直接被Exo Ⅰ水解，考察5 U/μL Exo Ⅰ 用量（0.5， 0.8， 1.0， 1.2， 1.5和1.8 μL）的影响（图6）。SG用量为5×时，检测体系在520 nm处的荧光强度。结果表明，随Exo Ⅰ用量增加，更多的DNA被Exo Ⅰ水解，体系荧光强度降低，当Exo Ⅰ用量为1.2 μL，体系荧光强度最低，继续增加浓度荧光强度变化不大，因此本实验中Exo Ⅰ用量为1.2 μL。

3.3 方法的线性范围和检出限

在最佳实验条件下，测定不同浓度的Hg2+与DNA传感器作用后的荧光光谱（λex = 480 nm， λem = 520 nm），结果如图7a 所示，随着Hg2+浓度不断增加，520 nm处的荧光强度IF逐渐增大。在Hg2+浓度在2～500 nmol/L范围内，IF与Hg2+浓度的对数呈良好的线性关系（图7b），回归方程为IF =563805lgC + 56994，相关系数（R）为0.9906，检出限1.5 nmol /L （3σ） （0.3 μg/L）。尿汞水平在一定程度上反映了人接触汞的程度，人体尿汞正常的参考范围为 ≤25 nmol/L[19]。本方法的检出限以及线性范围下限远小于人体尿汞正常含量最大值，可以满足临床检测需要。

3.4 特异性考察

考察了本方法检测Hg2+的选择性。将Pb2+， Ni2+， Cu2+， Co2+， Fe2+， Ca2+及Zn2+添加到尿样中，在最佳实验条件下进行测定。当干扰离子浓度高于Hg2+浓度100倍时，不同阳离子的荧光响应情况如图8所示，只有Hg2+能使体系信号明显增加，说明该荧光传感器对Hg2+有良好的特异性。

3.5 实际尿液样品中Hg2+的检测

选择原子荧光光谱法未检出Hg的尿液样品进行标准加入实验，计算回收率和相对标准偏差，结果如表1所示。3个水平的加样回收率为91.2%～95.0%，相对标准偏差为2.1%～4.6%。表明本方法准确度和灵敏度良好，能够满足生物试样中Hg2+污染检测的要求。此外，实验表明，尿样中的复杂成分（无机类的钠、钾、氯、硫酸盐、磷酸盐、铵盐、Ca2+等；有机物质包括尿素、尿激酶、表皮生长因子、生长激素、促红细胞生长素、促性腺激素、血管舒缓素和抗肿瘤肽类物质等）对Hg2+检测无影响，表明本方法具有良好特异性。

取两例病人尿样样本（原子荧光光谱法检测总汞含量分别是17.3和12.2 nmol/L，），按照2.2.4的方法将尿样中其它形式的汞转变成Hg2+，然后在最佳实验条件下检测总汞含量，检出量分别为17.1和12.5 nmol/L，相对标准偏差为3.6%～5.5%（n=5）。检测结果与原子荧光光谱法一致，表明本方法准确度和灵敏度良好，有望用于临床实际样本的检测。

4 结 论

用微孔板上固定DNA作为识别分子，发展了一种基于核酸外切酶I的荧光传感平台，实现了尿样中Hg2+ 的荧光分析检测。本方法操作简便、灵敏度高、特异性好，满足高通量样品检测的需求，适合现场即时分析，对于临床样品中尿液汞的检测具有重要意义。同时，本研究为血液、头发等生物样品中总汞的检测提供了新思路。

References

1 CHEN Ying， SHAO YuFang. Environmental Chemistry， 2012， 31（12）： 1934-1941

陈 影， 邵玉芳. 环境化学， 2012， 31（12）： 1934-1941

2 ZHAO Jing， SUN HaiJuan， FENG XuQiao. Science and Technology of Food Industry， 2014， 35（7）： 357-363

赵 静， 孙海娟， 冯叙桥. 食品工业科技， 2014， 35（7）： 357-363

3 Shah A Q， Kazi T G， Baig J A， Afridi H I， Arain M B. Food Chem.， 2012， 134（4）： 2345-2349

4 de Jesus A， Zmozinski A V， Vieira M A， Ribeiro A S， da Silva M M. Microchem. J.， 2013， 110（9）： 227-232

5 Yun Z J， He B， Wang Z H， Wang T， Jiang G B. Talanta， 2013， 106（6）： 60-65

6 da Silva D G， Portugal L A， Serra A M， Ferreira S L C， Cerdà V. Food Chem.， 2013， 137（14）： 159-163

7 de Souzaa S S， Campiglia A D， Barbosa F. Anal. Chim. Acta， 2013， 761（2）： 11- 17

8 WANG Meng， FENG WeiYue， ZHANG Fang， WANG Bing， SHI JunWen， Li Bai， CHAI ZhiFang， ZHAO YuLiang. Chinese J. Anal. Chem.， 2005， 33（12）： 1671-1675

王 萌， 丰伟悦， 张 芳， 汪 冰， 史俊稳， 李 柏， 柴之芳， 赵宇亮. 分析化学， 2005， 33（12）： 1671-1675

9 ZHANG QinLong， GAO Ge， LIU YaPan. Chinese Journal of Health Laboratory Technology， 2015， 25（20）： 3416-3418

张钦龙， 高 舸， 刘亚攀. 中国卫生检验杂志， 2015， 25（20）： 3416-3418

10 YANG XueJi， HUNG CanDong. Physical Testing and Chemical Analysis Part B： Chemical Analysis， 2015， 51（7）： 955-958

杨雪姬， 黄灿东. 理化检验化学分册， 2015， 51（7）： 955-958

11 LEI ZhaoJing， ZHANG CunZheng， HU QiuHui， LIU Yuan， ZHANG Qiang， LIU XianJin. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（12）： 1827-1831

雷兆静，张存政，胡秋辉，刘 媛，张 强，刘贤金. 分析化学， 2012， 40（12）： 1827-1831

12 ZHAI Kun， XIANG DongShan， ZHU Jun， HU HongQing. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（8）： 1125-1129

翟 琨， 向东山， 朱 俊， 胡红青. 分析化学， 2015， 43（8）： 1125-1129

13 Lu C， Huang P J， Ying Y， Liu J. Biosens. Bioelectron.， 2015， 79：244-250

14 ZHAO QiuLing， LIU LingLing， YANG LiNa， ZHANG ZhenYu. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（5）： 683-688

赵秋伶， 刘玲玲， 杨丽娜， 张振宇. 分析化学， 2014， 42（5）： 683-688

15 WEN Li， XU FengZhou， HE XiaoXiao， WANG KeMin， HE DingGeng， QING TaiPing， ZOU Zhen. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（11）： 1620-1628

文 立， 徐凤州， 何晓晓， 王柯敏， 何定庚， 卿太平， 邹 振. 分析化学， 2015， 43（11）： 1620-1628

16 GB60288， Chemical Reagent Preparation of Stock Standard Solutions. National Standards of the People′s Republic of China

化学试剂杂质测定用标准溶液的制备， 中华人民共和国国家标准. GB60288

17 YU Li， CHEN Chun， LI Bei， LU XinYan， LIU Dan， GAO Yong. Environmental Monitoring in China， 2014， 30（1）： 128-137

于 莉， 陈 纯， 李 贝， 路新燕， 刘 丹， 高 勇. 中国环境监测， 2014， 30（1）： 128-137

18 Yuan M， Zhu Y， Lou X， Chen C， Wei G， Lan M， Zhao J. Biosens. Bioelectron.， 2012， 31（1）： 330-336

19 LU Jun， GAO ShuMei， XIONG Jie， YANG YouYi， CHEN GuoQing. Lsaer Technology， 2010， 34（1）： 45-47

陆 俊， 高淑梅， 熊 婕， 杨幼益， 陈国庆. 激光技术， 2010， 34（1）： 45-47

20 YANG ShuiLian， NI WeiMin， LI XiaoJun， QIU ChuanYi， SUN DaoYuan， ZHAO LiQiang， SHAN HaoLin， HUANG ZhenNong， XIE LanLan， YOU QuanCheng， FENG KeYu. Chinese Journal of Industrial Hygiene and Occupational Diseases， 2006， 24（7）： 418-419

Abstract A novel fluorescence analysis method for fast detection of mercury ions in human urine was established based on DNA recognition and exonuclease I （Exo Ⅰ） assisted signal conversion strategy. The DNA immobilized on the surfaces of the microplates bound specifically with Hg2+ to fold into a stable “hairpin” doublestranded structure， thus avoided the hydrolysis by singlestranded DNA specific Exo Ⅰ. Nucleic acid dye SYBR Green I （SG） could insert into the doublestranded "hairpin" part to produce fluorescence signal emission. Based on the above facts， quantitative detection of mercury ions was achieved. The experimental results showed that， when the concentration of avidin coating solution was 50 mg/L and the concentration of the detection DNA immobilized on the microplate was 75 nmol/L， with 5SG and 1.2 μL of Exo Ⅰ， the optimal analytical performance could be achieved. A good linear relationship between the fluorescence intensity of the system at 520 nm versus the logarithm of mercury ions concentration in the range of 2-500 nmol/L was obtained under the optimal conditions， and the detection limit was 1.5 nmol/L （3σ）. The recoveries of mercury in spiked human urine samples were 96.3%-100.5% with the relative standard derivations （RSDs） of 2.1%-4.6%. The method had good selectivity with simple operation， and could be used for the detection of total mercury content after oxidizing other forms of mercury in urine into mercury ions using HNO3KMnO4 oxidation method.

Keywords DNA recognition； Exonuclease I； Mercury ion ； Signal amplification strategy； Fluorescence analysis