关于鱼类病毒病诊断技术的探讨

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一、鱼类病毒病的发生特点

一是养殖品种不明病因的疾病增加;二是疾病种类、复合发病多，往往是同一片池塘可同时发生不同的病害，造成控制难度大;三是病程时间长，发病面积广，一些病害全年均有发生;四是一些疾病在局部地区暴发性频率增加，病害控制难度非常大，造成重大经济损失。

二、病毒及鱼类病毒病的主要特点

病毒的概念：病毒是一类超显微的非细胞生物（绝大多数病毒是能通过细菌滤器的微小颗粒，因此必须通过电子显微镜才能观察其具体形态和大小），每一种病毒只含有一种核酸，或是DNA，或是RNA;它们只能在活细胞内营专性寄生，靠其宿主代谢系统的协助来复制核酸、合成蛋白质等组分，然后再进行装配而得以增殖;在离体条件下，它们能以无生命的化学大分子状态长期存在并保持其侵染活性。

鱼类病毒病的主要特点：一是鱼类感染病毒性疾病有潜伏期，只有在一定的温度条件下才发病;二是病毒病往往来势凶猛，可造成养殖鱼类的全军覆灭;三是在鱼体内杀死病毒非常困难，只有以预防为主，不让鱼与病毒接触。

三、PCR技术

1、PCR是近十年来发展和普及最迅速的分子生物学新技术之一，是一项在短时间内大量扩增特定的DNA片断的分子生物学技术，它具有强大的扩增能力，敏感性和特异性大大增强。由于PCR对世界生物医学研究的巨大推动作用，其发明者Saiki因而获得1992年诺贝尔医学奖。

2、PCR技术原理

PCR通常需要两个位于待扩增片断两侧的寡聚核苷酸引物。这些引物分别于待扩增片段的两条链互补并定向，使两引物之间的区域得以通过聚合酶而扩增。反应过程为首先必须使得待扩增DNA（称为模板）置于高温下解链成单链模板，这一过程叫变性。第二步为分别与待扩增的DNA片段两条链的3′端互补的人工合成的寡聚核苷酸引物在低温条件下分别与模板两条链两侧互补结合，这一过程叫退火。第三步是DNA聚合酶在适当温度下将脱氧核苷酸沿引物5′-3′方向延伸合成新股DNA，这一过程叫延伸。变性—退火—延伸，如此循环往复，每一循环产生的新股DNA均能成为下一次循环的模板，故PCR产物是以指数方式，即2n扩增的，经过30-35个循环，目的片段可以扩增到100万倍，在一般PCR仪上，完成这样的反应需几个小时。

PCR体系中的基本要素是：（1）DNA模板可以是单链或双链，可以是提取的染色体DNA，亦可是克隆的质粒DNA;可以是线性，亦可是环状DNA分子。（2）一对寡聚DNA引物，分别与模板DNA链两侧的3′端序列互补，可使二者间的DNA序列得到扩增。（3）耐热DNA聚合酶通常是TaqDNA聚合酶与其它类似物，可在高温下（72℃）催化DNA合成，并且加热至95℃不会变性。（4）缓冲液提供DNA合成反应所需pH、离子强度等环境。（5）4种单核苷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）提供DNA合成的原料。

3、实验材料

器材：离心机、PCR扩增仪、PCR反应管、冰盒、水平式电泳凝胶设备、TIP、加样器、紫外灯、冰箱、冰柜等。

试剂：模板DNA、PCR引物、TaqDNA聚合酶、dNTPS、10×PCR反应缓冲液、氯化镁、去离子水、紫外灯、矿物油。

4、实验方法

（1）、基本PCR技术扩增方案

按下列程序依次加入试剂，按50ul反应体积配制反应体系（注意：水先加，然后依次加入其他试剂，模板DNA最后加）。

按表1将各成分依次加到0.2mlPCR反应专用薄壁管内[注意：实验中应设立对照。阴性对照（不加模板DNA）可加去离子水代替]。

阳性对照（含目的序列DNA）

将上述液体混合，短暂离心以集中液体，置PCR仪依表2所述条件进行反应。

（2）PCR产物的凝胶电泳检测

取5ulPCR反应液置琼脂糖凝胶电泳，经溴化乙啶染色后在紫外灯下观察结果。成功的扩增结果应为明显的，单一的荧光带，并和预先设计的片段大小一致。

注意：上述所介绍的实验方法为基本PCR技术方法。在实际检测过程中，要根据所要检测的具体种类的鱼类病毒，使用该类病毒检测的标准方法。

5、注意事项

PCR反应体系中的任何一个成分，对其结果都是非常重要的。由于PCR是以指数方式扩增加，极微量的DNA污染都可能造成假阳性结果，因此反应体系的干净程度是非常重要的。需要实验者在操作中加以注意的问题如下：

（1）合理分隔实验室：根据各实验室不同的条件可分为样品的处

理、配制反应液、循环扩增及产物的鉴定4部分。实验前应用紫外线消毒以破坏残留的DNA及RNA。

（2）分装PCR试剂：所有的PCR试剂都应小量分装，-20℃保存。

（3）设立适当的阳性对照和阴性对照：为确保结果的可肯定性，每次反应都应有设置严格的对照：一是阳性对照，阳性模板;二是阴性对照，不含有被扩增核酸的样品作阴性对照;三是空白对照（或试剂对照），一管不加模板的试剂对照。

（4）防止操作人员污染：尽量一次性使用手套、吸头、离心管。选择质量好的PCR反应管，打开离心管前应先离心，开管动作要轻，以防管内液体溅出。

（5）加样器：由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因此吸样要慢，尽量一次性完成，忌多次抽取，以免交叉污染或产生气溶胶造成污染。设置专用的加样器用于PCR，这套加样器不能用于PCR的反应产物分析。