一株高产淀粉酶放线菌的筛选鉴定及产酶条件优化

摘要：利用透明圈法和摇瓶发酵法从对虾养殖池塘底泥中筛选出1株淀粉酶高产菌株，扫描电子显微镜观察菌株的亚显微形态，生化方法测定了菌株的生理生化指标，分子生物学方法分析了菌株的16S rRNA序列，同时响应面法优化了该菌株的产酶条件。结果表明，根据菌株的亚显微形态、生理生化特征和16S rRNA序列比对，确定该菌株为卢森坦拟诺卡氏菌（Nocardiopsis lucentensis）;该菌株的最适产酶条件为初始pH值8.8、盐度60‰、温度40 ℃。筛选到的淀粉酶高产菌株，能够为工业生产提供耐盐碱淀粉酶储备菌株。

关键词：淀粉酶;卢森坦拟诺卡氏菌;亚星微形态;生理生化特征;RNA序列对比;产酶条件;响应法

中图分类号： S182  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）17-0288-04

淀粉酶是水解淀粉和糖原的一类酶的统称，其产量约占工业酶总产量的85%以上。淀粉酶在食品、焙烤、发酵、纺织、轻工业、畜牧业生产及医药产业中得到广泛应用[1-5]。但是在工業化生产中高盐、碱性等严苛条件制约着淀粉酶的应用。在此条件下，淀粉酶的稳定性下降，酶活力大幅度损失或者完全丧失，因此开发具有高稳定性的生物酶，使其能够适应高盐、碱性等工业环境，成为近年来亟待解决的重要难题。嗜盐细菌对外界自然环境的盐度具有极强的适应性，是一类重要的极端微生物资源。嗜盐菌可以在较高的盐度环境中生长，其最适盐浓度一般为0.5%～36.0%[6]。为了适应高盐度环境，这类细菌产生的各种酶往往具有一些独特的生物学特性，如耐盐、耐高或低pH值、耐碱等。因此，筛选高效耐盐碱淀粉酶产生菌株，并将其应用于工业化生产，具有重要的科学意义与实践价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验菌株从天津市汉沽南美白对虾养殖池塘底泥中筛选得到。

1.1.1 培养基 改良察氏培养基：NaNO3 3.00 g、K2HPO4 1.00 g、MgSO4 0.50 g、KCl 0.50 g、FeSO4 0.01 g、可溶性淀粉30.00 g、蒸馏水1.00 L，pH值7.2～7.4，固体培养基添加琼脂粉1.8%，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。改良LB培养基：蛋白胨10 g、NaCl 15 g、可溶性淀粉10 g、蒸馏水1 L，pH值 7.2～7.4，固体培养基添加琼脂粉1.8%，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

DNA提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司;化学试剂均为分析纯，购自北京索来宝生物科技有限公司。

1.1.2 试验仪器 立式双层小容量恒温培养摇床（上海新苗医疗器械制造有限公司）;全温型多振幅轨道摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）; 立式蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）;PCR扩增仪（美国伯乐公司）;高速冷冻离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）;生物显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）;精密pH计（天津市盛邦科学仪器技术开发有限公司）;CO2培养箱（美国Thermo公司）;电子分析天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司]。

1.2 试验方法

1.2.1 淀粉酶产生菌株的筛选 取1 g池塘底泥，加入已灭菌的100 mL察氏培养基中，于30 ℃、120 r/min下恒温振荡富集培养，3 d后取5 mL培养液，转接至察氏培养基中，相同条件培养3 d。

无菌条件下对富集培养液进行梯度稀释，并在固体察氏培养基上进行涂布，30 ℃培养，3 d后在平板上滴数滴碘液，选取透明圈明显的菌株进行平板划线分离纯化。经过复筛，获得淀粉酶高产菌株，编号为EPM。

1.2.2 菌株的鉴定

1.2.2.1 菌株的形态学特征 菌株纯化后接种到察氏培养基中，30 ℃恒温培养3 d，革兰氏染色观察菌体的显微形态，扫描电镜下观察菌体的亚显微形态。

1.2.2.2 16S rRNA序列分析 试剂盒法提取细菌总DNA，16S rRNA通用引物（27F和1 495R）进行PCR扩增，反应体系（50 μL）为10×Buffer 5.0 μL;dNTPs 4.0 μL;27F 1.0 μL;1492R 1.0 μL;Taq酶0.5 μL;DNA模板2.0 μL;蒸馏水 36.5 μL。扩增程序为预变性94 ℃ 5 min;变性94 ℃ 30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环;72 ℃维持10 min。

PCR产物送交北京奥科生物技术有限责任公司测序，所得序列提交GenBank数据库，并进行Blast分析比对。

1.2.3 淀粉酶活性的测定 3，5-二硝基水杨酸试剂显色法测定淀粉酶活性[7]。以0.1 μL粗酶液，1 min水解淀粉产生相当于1 μg葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活单位（U）。

1.2.4 菌株EPM产酶条件优化 中心组合Box-Behnken优化试验，pH值、温度及盐度为自变量，以淀粉酶活性为响应值（Y），探讨3个因素对淀粉酶活性的影响，试验因素与设计见表1。

2 结果与分析

2.1 菌株EPM的筛选

从对虾养殖池塘底泥中筛选到透明圈直径较大的淀粉酶高产菌株EPM。由图1可知，此菌株产生的淀粉酶活性较高，菌株菌落为白色、不透明、圆形、边缘粗糙，生长过程中会产生抗生素药物的气味。

2.2 菌株EPM的鉴定

2.2.1 菌株的生理生化特征 菌株EPM的生理生化指标测定结果见表2。菌株EPM能够利用葡萄糖，不能利用乳糖，甲基红与靛基质试验为阴性，V-P试验为阳性，不产生硫化氢，不利用柠檬酸盐，可还原硝酸盐，能够形成菌膜，为革兰氏阳性菌。

2.2.2 菌株EPM的亚显微观察 由图2可知，扫描电镜下观察，菌株菌丝呈多层纤维状结构，菌丝宽度为0.5～1.0 μm，有些会断裂为短杆状。

2.2.3 菌株EPM的16S rRNA序列分析 用DNA纯化试剂盒对所提取的DNA进行纯化后，用16S rRNA通用引物进行PCR扩增，扩增产物的琼脂糖电泳图谱如图3所示。对PCR产物进行测序，将所得序列输入GenBank中，与NCBI中Microbial Nucleotide Blast进行比对，卢森坦拟诺卡氏菌（Nocardiopsis lucentensis）与此序列同源性最高，达99%。

结合以上EPM的菌落形态、菌株的亚显微形态、菌株的生理生化特征及16S rRNA序列分析，确定筛选到的菌株为卢森坦拟诺卡氏菌。

2.3 菌株的产酶条件优化

按照表1设计方案进行响应面试验，结果见表3。

采用Design expert 7.0软件对上述结果进行数据整理和分析，二次回归模型进行拟合，回归分析结果见表4、表5及表6。

P值小于0.05，表示该项指标显著，从表4可以看出，模型的P值小于0.05，说明该模型显著，一次项中A、B的P值均小于0.05，说明它们对响应值的影响显著，二次项中A2、B2、C2的P值均小于0.05，说明所选3个因素的二次项对响应值影响显著。表4的P值表明，在所选定的各因素水平范围内，对响应值的影响排序为温度>盐度>pH值。

回归模型中失拟项的P值大于0.05（表5），说明失拟项不显著，所选模型与实际情况拟合程度高，不需要引入更高次数的项，模型适当。

回归模型的复相关系数为0.960 3，校正相关系数为 0.889 0（表6），达到了较好水平，说明模型的预测值和实测值拟合较好，信噪比较大，说明这个模型能较好地反映试验结果。

最终拟合得到的二次回归方程为Y=1.350 0-0.160 0A-0.140 0B+0.005 7C-0.100 0AB-0.089 0AC-0.096 0BC-0.600 0A2-0.290 0B2-0.330 0C2。

由响应面回归分析和回归方程擬合，绘出响应面分析图，见图4至图6。

从图4可以看出，随着pH值和温度的升高，酶活性也随之增大，当pH值和温度升高到一定程度时，酶活性达到最大，pH值和温度继续升高时，酶活性又会随之下降，说明pH值和温度取某个适中值时，酶活性达到最大。同理，从图5、图6可以发现，pH值和盐度、温度和盐度同样对酶活性是非线性的，对酶活性同样存在二次项。通过软件优化、模拟得到最佳产酶条件为pH值8.8、温度39.19 ℃、盐度60.32‰，预测的淀粉酶活性为1.332 U/μL， 经3次验证试验， 实际测得淀粉酶活性为 1.356 U/μL。考虑到操作的便利，将培养条件修正为pH值 8.8、温度40 ℃、盐度60‰，在此条件下进行验证，实际测得淀粉酶活性为1.349 U/μL，验证试验和修正试验所得淀粉酶活性与理论值相差很小，说明采用响应面法优化得到的产酶条件参数准确可靠，模型具有较高的应用价值。

3 讨论

拟诺卡氏菌是一种重要的资源微生物。一些学者在拟诺卡氏菌资源收集、生态学及天然产物等方面开展了较多研究工作，探索了拟诺卡氏菌地理分布格局、适应极端环境机制，分离到多种化学结构丰富、活性新颖的新化合物，以及可降解淀粉、蛋白质、纤维素和木聚糖等生物大分子的具有耐冷、耐碱或耐热等特殊性质的酶[8-9]。笔者所在课题组从南美白对虾养殖池底泥中筛选到1株高产淀粉酶菌株，经过系列生理生化特征及16S rRNA序列分析，确定该菌株为卢森坦拟诺卡氏菌。

中度嗜盐菌因其具有较大的盐度适应性，并应用广泛，引起了人们的极大关注。1978年，Kushner对中度嗜盐菌定义为在0.5 mol/L（约3%）～2.5 mol/L（约15%）NaCl浓度之间有最佳生长的细菌[10]。1993年，Ramos-Cormenzana将中度嗜盐菌定义为在5%～20%盐度范围内能够最佳生长的细菌[11]。中度嗜盐菌在降解有毒化合物、环境污染治理等方面有重要的应用前景[12-13];中度嗜盐菌产生的酶如淀粉酶、核酸酶、蛋白酶等能够抑制某些植物病原真菌，还可用于实际生产生活中[14]。

本研究从对虾养殖池底泥中筛选到卢森坦拟诺卡氏菌，其淀粉酶活性达1 000 U/mL以上，高于芽孢杆菌属菌株产生的淀粉酶活性（293.8 U/mL）[15]，后者的最适盐度为50‰，属于中度嗜盐菌。通过响应面法，笔者所在课题组优化了卢森坦拟诺卡氏菌的产酶条件，最适盐度为60‰，pH值为8.8，说明该菌株在盐度较高、碱度较大的环境中具有较好的淀粉酶产生能力，预示着该菌株在高盐高碱的环境中具有较大的应用前景，可应用于工业、食品和污水处理等方面。

参考文献：

[1]Marc J E C van der Maarel，Veen B V D，Uitdehaag J C M，et al. Properties and applications of starch-converting enzymes of the α-amylase family[J]. Journal of Biotechnology，2002，94（2）：137-155.

[2]Sivaramakrishnan S，Gangadharan D，Nampoothiri K M，et al.α-amylases from microbial sources-an overview on recent developments[J]. Food Technology and Biotechnology，2006，44（2）：173-184.

[3]Asgher M，Asad M J，Rahman S U，et al. A thermostable α-amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing[J]. Journal of Food Engineering，2007，79（3）：950-955.

[4]楼 超，刘铁帅，贾博深，等. 高产淀粉酶菌株的筛选及产酶条件优化的探究[J]. 中国卫生检验杂志，2010，20（11）：2817-2820.

[5]Zoe K，Mariaia L K. Thermostable α-amylase production by Bacillus subtilis entrapped in calcium alginate gel capsules[J]. Enzyme and Microbial Technology，2006，39（4）：690-696.

[6]Ventosa A，Nieto J J，Oren A，et al.Biology of moderately halophilic aerobic bacteria[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews，1998，62（2）：504-544.

[7]林加涵，魏文铃，彭宣宪. 现代生物学实验[M]. 北京：高等教育出版社，2001，5-7.

[8]王飞飞. 沙漠土壤拟诺卡氏菌次级代谢产物的研究[D]. 北京：北京协和医学院，2014.

[9]吴少杰，马桂珍，王淑军，等. 一种海洋拟诺卡氏菌产生的胞内中性β-葡萄糖苷酶[J]. 海洋科学，2013，37（4）：41-46.

[10]Kushner D J. Life in high salt and solute concentrations：halophilic bacteria[M]. London：Microbial Life in Extreme Environments，1978：317-368.

[11]Ramos-Cormenzana A. Ecology of moderately halophilic bacteria[M]. Boca Raton：The Biology of Halophilic Bacteria，1993：55-86.

[12]Lefevre E，Round L A. A preliminary report upon some halophilic bacteria[J]. Journal of Bacteriology，1919，4（2）：177-182.

[13]Bajpai P. Microbial degradation of pollutions in pulp mill effluents[J]. Advances in Applied Microbiology，2001，48（48）：79-134.

[14]Gupta S，Kuhad R C，Bhushan B，et al. Improved xylanase production from a haloalkalophilic Staphylococcus sp. SG-13 using inexpensive agricultural residues[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2001，17（1）：5-8.

[15]曹廷鋒，肖 静，侯运华，等. 一株高产淀粉酶嗜盐海洋菌的筛选鉴定及其发酵条件研究[J]. 中国酿造，2011，30（10）：86-90.