UPLC—MS/MS研究披针灰叶素B在不同种属肝微粒体中的代谢稳定性及代谢酶表型

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[摘要]应用体外肝微粒体孵育体系，研究披针灰叶素B（lanceolatin B）在大鼠、人、比格犬、猴肝微粒体中的代谢稳定性及体外代谢参数，确定主要代谢披针灰叶素B的CYP酶表型。将披针灰叶素B与不同种属肝微粒体共同孵育，应用UPLC-MS/MS检测孵育液中披针灰叶素B的含量，考察其代谢稳定性与体外代谢动力学参数。将披针灰叶素B与各CYP450同工酶CYP2E1，2C19，1A2，2D6，2C9，3A4，2A1的特异性抑制剂共同孵育，确定其代谢酶表型。研究结果显示，披针灰叶素B在人、比格犬肝微粒体中不代谢，而在大鼠与猴肝微粒体中可代谢，它们的体外半衰期（T_1/12）与固有清除率（CL_int）分别为11.57，8.07min和0.12，0.17mL·min^-1i·mg^-1，结果没有显著性差异；披针灰叶素B在肝微粒体中的代谢存在种属差异，在大鼠肝微粒体中由多个酶共同参与代谢，其中CYP1A2酶的作用最强，是主要代谢披针灰叶素B的酶。

[关键词]披针灰叶素B；肝微粒体；代谢稳定性；酶表型；TIPLC-MS

披针灰叶素B（lanceolatin B）是一种呋喃黄酮类化合物，其结构式见图1，广泛存在于水黄皮Pongamia pinnata（L.）Pierre、印度崖豆Mille-ttia pulchra、孟连崖豆M.griffithii和灰毛豆Tephrosia purpurea等多种药用植物中；现代药理研究表明，披针灰叶素R具有抗炎抗疟原虫、抗菌、抗肿瘤等作用：据文献报道，披针灰叶素B已能够全合成且合成工艺简单，收率高，提示在天然药用资源不足的情况下，可通过全合成的方法获得披针灰叶素B，这使其具有了开发利用的潜力与价值：目前在体外代谢方面并未见披针灰叶素B的相关报道，因此本文研究了披针灰叶素B在不同种属动物肝微粒体中的体外代谢，以期为其进一步研究与开发利用提供参考。

1材料

Waters Acquity^TM超高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪（UPLC-MS），包括PDA紫外检测系统（PDA detector）、二元泵溶剂系统（Waters Binary Sol-vent Manager）、进样系统（Waters Sample Manager）、电喷雾离子源（ESI）接口、Quattro Premier^XE三重四级杆质谱仪、MassLvnx V4.1数据采集与处理软件（美国Waters公司）：Thermo Heraeus Fresco 17低温冷冻离心机（Thermo Scientific公司）；230V-UK涡旋混合器（Labnet International公司）：BT 125D电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）：Milli-Q超纯水系统（美国Merck Millipore公司）。

披针灰叶素B为四川大学生物治疗国家重点实验室从崖豆藤属植物孟连崖豆M.griffithii的藤茎中分离而得，经UV，¹H和¹³CNMR，HMBC，HMQC谱学分析鉴定其结构，并经RP-HPLC测定，用峰面积归一化法计算其纯度为99.94%：刺芒柄花素对照品（内标，批号01112916）购于INDOFINE chemi-cal公司：奎尼丁（quinidine，QND）购于TCI上海化成工业发展有限公司：α-萘黄酮（alpha-naphthofla-vone，ANF）购于东京化成工业株式会社：二乙基二硫代氨基甲酸钠（sodium diethvldithiocarbamatre，DDTC）、磺胺苯吡唑（sulphaphenazolum，SPP）均购于美国Sigma公司；盐酸噻氯匹定（ticlopidine hydro-chloride，TCP）、毛果芸香碱（pilocarpine，PCP）购于中国食品药品检定研究院；酮康唑（ketoconazole，KCZ）购于德国Dr Ehrenstorfer公司：SD大鼠、人、比格犬、猴肝微粒体（20 g·L^-1）及NADPH发生系统均购自武汉普莱特生物医药技术有限公司，并于-80℃冻存：甲醇为色谱纯（美国Fisher公司）：水为Milli-Q超纯水。

2方法

2.1对照品溶液的配制