丙型肝炎病毒核心抗原酶标抗体的制备及ELISA检测方法的建立

摘 要：将抗丙型肝炎病毒核心抗原抗体（Anti-HCV Core protein）应用过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶（HRP），制备抗丙型肝炎病毒核心抗原酶标抗体，根据酶联免疫操作步骤，应用美国Ortho公司试剂盒的其它组分，建立一种丙型肝炎病毒核心抗原双抗夹心检测法，并对比市场上的试剂盒进行检测。

关键词：丙型肝炎病毒核心抗原；辣根过氧化物酶；标记；临床

DOI：10.16640/j.cnki.37-1222/t.2016.19.224

0 引言

丙型病毒性肝炎，简称为丙型肝炎、丙肝，是一种由丙型肝炎病毒（HCV）感染引起的病毒性肝炎，主要经输血、针刺、吸毒等传播。

本实验通过用辣根过氧化物酶（HRP），对抗丙肝核心抗原抗体进行标记，利用美国ortho公司成品试剂盒的其他组分，组装形成丙型肝炎核心抗原检测试剂盒，验证自制试剂盒的准确性、特异性以及与ortho公司产品的相关性。

1 材料和方法

1.1 材料

（1）实验试剂。辣根过氧化物酶（sigma）；过碘酸钠（百灵威科技有限公司）；抗HCV-cAg单克隆抗体（美国赛莱克斯cellex公司）；丙型肝炎核心抗原检测试剂盒（美国0rtho公司）；0.2mol/L，pH5.6醋酸盐缓冲液；0.01mol/L，pH7.4 磷酸盐缓冲液；1.0mol/L， pH9.5 碳酸盐缓冲液。（2）主要仪器。BIOBASE8001全自动酶免工作站，山东博科生物产业有限公司；BIOBASE洗板机，山东博科生物产业有限公司；DHP-260恒温培养箱，常州中捷实验仪器制造有限公司；微孔板恒温振荡器，上海岛韩实业有限公司；高速冷冻离心机，中科中佳 HC-3018R。

1.2 实验方法

（1）试剂盒的应用及检测实际操作。（2）样品排布。利用自产的试剂盒与美国ortho公司的对照，检测临床42个样本，对阴阳性符合率进行验证。每个样本先用ortho公司的检测。（3）试剂盒的特异性。选取临床上的病理样本，分别为27例类风湿因子（RF）阳性样本，25例免疫球蛋白阳性样本，18例自身抗体阳性样本（上述样本抗HCV和HCV均为阴性），用自配制的酶标抗体和ortho公司的酶标抗体各检测一次，验证试剂盒的特异性。（4）相关性。选择临床上丙型肝炎病毒核心抗原强阳性样本，对该样本进行等比稀释。

分别利用自制试剂盒与Ortho试剂盒对每个样本重复进行两次检测，获得其吸光强度，比对两个试剂盒的相关性。

2 结果与分析

（1） 试剂盒准确度分析。通过对42个样本进行检测，其96孔板显色程度所示。通过样本检测显色结果显示，美国ortho公司的试剂盒显色强度要比自制试剂显色强度要高，但是阴阳性检测结果是完全一致的，即该42个样本中，有8个阳性样本，两试剂盒检测均为阳性，其他样本两试剂盒检测均为阴性，阴阳性符合率为100%。通过该检测结果，自制的酶标抗体，结合美国ortho公司其他试剂盒组分，组成的自制丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒与对照试剂盒准确度一致，显色强度低说明酶标抗体的浓度与对照试剂盒相比偏低，但是对试剂盒检测没有影响，而且还可以节省试剂盒成本。

（2）试剂盒特异性分析。利用两个试剂盒对27例类风湿因子（RF）阳性样本，25例免疫球蛋白阳性样本，18例自身抗体阳性样本（上述样本抗HCV和HCV均为阴性），进行检测结果如表1所示。通过以上对于70例病理阳性样本的检测，自制丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒的特异性较美国ortho公司的成品试剂盒有微弱差异，25例免疫球蛋白阳性样本中，自产试剂盒检测有1例为阳性，因此免疫球蛋白会对自产试剂盒存在干扰，该原因主要是购买的抗体没有经过纯化，可能存在非特异性结合。检测抗干扰能力为98.5%，比成品试剂盒较差，但是完全可以满足临床要求。

（3）线性相关性检测。通过BIOBASE8001全自动酶免工作站对显色强度进行检测，根据统计的吸光强度获得线性关系如图1所示。以美国ortho公司的检测结果为横坐标，以自产试剂盒的检测结果为纵坐标，进行直线回归统计分析，得回归方程为y=0.8878x+0.0007，r=0.9976， r>0.990，可以认为两种方法具有极佳的相关性。

3 结论

通过过碘酸钠方法，用辣根过氧化物酶对丙型肝炎病毒核心抗原的抗体进行标记，结合美国ortho公司的丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒的组分，组装了自产的试剂盒，用以对丙型肝炎病毒核心抗原进行检测。通过对比美国ortho公司的试剂盒，进行准确度、特异性和相关性的分析，两试剂盒检测阴阳性符合率达到100%，抗干扰性为98.5%，线性相关系数r=0.9976。该研究对国内临床对于丙型肝炎的检测具有潜在的应用价值。

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作者简介：刘旭（1985-），男，山东成武人，本科，助理工程师，研究方向：医疗器械。