乌龙丹对胶原诱导关节炎大鼠血管内皮生长因子的影响

【摘 要】目的：通过观察乌龙丹对胶原诱导的类风湿关节炎模型大鼠的治疗作用及对血管内皮生长因子的影响，探讨乌龙丹的抗类风湿作用及其机制。方法：采用Ⅱ型胶原诱导大鼠建立类风湿关节炎模型， 通过测定其关节炎指数积分及关节肿胀率，评价乌龙丹的治疗作用，并以Elisa法检测血清及滑液中血管内皮生长因子表达情况，以进一步评价并探讨其作用机制。结果：给药28天后乌龙丹各治疗组模型大鼠关节炎指数积分及关节肿胀率明显降低；各治疗组血清及滑液中血管内皮生长因子均有不同程度下降，其中以中剂量组下降最为显著。结论：乌龙丹对胶原诱导的类风湿关节炎模型大鼠具有良好的治疗作用，其机制可能与降低血清及滑液中血管内皮生长因子的表达，从而抑制了滑膜血管增生及滑膜炎的发展有关。

【关键词】 乌龙丹；关节炎，类风湿；血管内皮生长因子；中药复方；动物实验

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者的关节滑膜组织是一种具有很强侵蚀作用的病变组织，其生长及病理学行为在许多方面类似于肿瘤组织。滑膜组织表现为增生性侵蚀性生长、滑膜组织肥厚、血管翳形成。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是参与RA滑膜病变中的重要细胞因子，促进了炎症的发展和滑膜新生血管的形成，通过一定的方式阻断滑膜中VEGF表达，有望成为治疗RA的一项新手段[1]。我们应用乌龙丹治疗RA，获得了良好的疗效。为了探讨其治疗机制，我们设计了如下实验。

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁级雄性Wistar大鼠（由黑龙江中医药大学实验动物中心提供）40只，体重为（l90±20）g，适应性饲养1周后进行实验。

1.2 主要试剂及药品 雷公藤多甙片（由三九黄石制药厂生产）；鸡Ⅱ型胶原（CⅡ）（由上海生物医学工程研究所生产），临用时，于无菌条件下用0.1 ml·L-l冰醋酸充分溶解，当CⅡ的浓度为

0.4 mg·ml-l时，置于4 ℃冰箱过夜后，与弗氏完全佐剂等体积混合，振荡乳化，制成CⅡ乳剂（每

0.5 ml含CⅡ1 mg）。VEGF测定所用Elisa试剂由上海生物医学公司提供。乌龙丹（乌骨藤、穿山龙、秦艽、杜仲、白芍、川断、木瓜、威灵仙组成）由黑龙江中医药大学药学院国家中药材规范化生产及质量标准实验室制备，每克浸膏相当于生药5.3 g，以生理盐水配制混悬液灌胃。

2 实验方法

2.1 胶原诱导的关节炎模型制备及分组 Wistar雄性大鼠适应性喂养1周后，随机选出8只为正常组。其余大鼠于颈、背部5个部位皮内注射CⅡ乳剂总量0.5 ml（含1 mgCⅡ）。第21天同法0.3 ml加强注射。将造模成功的40只大鼠随机分为模型组，阳性对照组，乌龙丹高、中、低剂量组，每组8只。

2.2 给 药 正常组与模型组给予1 ml蒸馏水灌胃；乌龙丹高、中、低剂量组分别给予14 g·kg-1、

7 g·kg-1、3.5 g·kg-1乌龙丹灌胃；阳性对照组给予9 g·kg-1雷公藤多甙片。各组均于造模第10天开始给药，共给药28天。

2.3 取 材 给药第28天，脱颈法处死大鼠，由眼眶取血，离心分离血清，同时以镊子拉开造模鼠足-踝关节，使关节腔增大，以装有1 ml蒸馏水的注射器反复冲洗关节腔，吸取关节滑液。采用Elisa法测定血清中VEGF含量，具体操作按试剂盒说明书进行。

2.4 实验数据采集与测定

2.4.1 大鼠一般状况 包括大鼠体重、毛色、反应、活动情况。

2.4.2 关节炎指数积分 采用Wood氏关节炎评估标准，4只足爪中每只足爪的损害都分为0～4级，计算四肢的总积分，最高分数为16分，给药后每7天评估积分1次，并进行记录。具体评分标准为0分：正常；1分：红肿涉及1个指关节；2分：红肿涉及2个及以上指关节或整个足爪轻度红肿；3分：足爪红肿较重；4分：足爪重度红肿，缺乏弹性。

2.4.3 关节肿胀率测定 造模后用水溶积置换法测定大鼠致炎侧，即左踝关节毛际以下容积。以第1天测得的值为基值，给药28天后测得的值与之相比所得比值为关节肿胀率。

2.4.4 血清与滑膜液VEGF含量测定 采用酶联免疫吸附法（Elisa）测定。

2.5 统计学方法 用SPSS13.0软件处理，结果用

表示，计量资料的组间比较采用单因素方差分析，组内比较釆用q检验、LSD检验、t检验方法，以P<0.05为差异有显著性；P<0.01为差异有高度显著性；P>0.05为差异无统计学意义。

3 结 果

3.1 大鼠一般情况 正常组大鼠体重不断增加，活动自如，皮毛有光泽，无明显异常出现；第2次免疫加强后，造模组大鼠出现体重增长缓慢，活动受限，毛发干枯；乌龙丹高、中、低剂量组均比模型组一般情况好，相比较而言，乌龙丹中剂量组一般情况最好。

3.2 各组大鼠关节炎指数积分 给药后第7天、14天、21天、28天，与模型组相比，乌龙丹各剂量组和阳性对照组的关节炎指数积分均降低，且具有显著性差异（P<0.01或P<0.05）；与阳性对照组比较，乌龙丹各剂量组的关节炎指数积分均有所提高，具有显著性差异（P<0.01）；乌龙丹组高、中、低剂量组之间比较，中剂量组对关节炎指数积分降低效果最好，且与低剂量组和高剂量组相比具有统计学意义（P<0.01）；与低剂量组相比，高剂量组关节炎指数积分降低的效果比低剂量组偏好，具有统计学意义（P<0.01），见表1。

3.3 关节肿胀率变化比较 各治疗组与模型组比较，关节肿胀率均有明显降低，具有显著性差异（P<0.01）；乌龙丹各剂量组与阳性对照组相比较，均有不同程度的改善，但是无统计学意义（P>0.05）；乌龙丹各剂量组间比较，高、中剂量组优于低剂量组，不过只有中剂量与低剂量组比较具有统计学意义（P<0.05），高剂量组与中剂量组比较无统计学意义（P>0.05），见表2。

3.4 血清与滑液VEGF含量 模型组大鼠血清及滑液VEGF检测结果见表3，可见大鼠血清及滑液中VEGF均有明显升高，与正常组比较具有显著性差异（P<0.01）；乌龙丹各剂量组与模型组相比较，均有不同程度的改善，其中乌龙丹中剂量组改善最为显著，与乌龙丹低、高剂量组相比较具有显著性差异（P<0.01或P<0.05）。

4 讨 论

RA是一种常见的以慢性滑膜增生为特点，进而导致关节软骨和骨进行性、不可逆性破坏的慢性、炎症性、自身免疫性疾病，最终导致关节畸形和功能丧失。滑膜炎和关节破坏是RA发病机制中两个最重要的病理环节。RA发病早期就以血管密度改变和新生血管形成为特征性表现。因为增生的滑膜需要血管代偿性增加[1]。RA的发生和发展的关键步骤就是新生血管生成，促血管形成因子包括白细胞介素-8（IL-8）和VEGF等[2]。

特别是VEGF，多项研究证明多种因素可上调VEGF[3]，促进血管生成，并导致持久性滑膜炎[3]，并且已证实VEGF与关节炎的严重程度正相关[1]。抑制VEGF可能是一个有希望的目标、新的治疗策略[1，3-6]。

RA属于中医学的尪痹、历节、鹤膝风等范畴，其病因病机主要是正气亏虚，风寒湿热之邪外袭，痹阻经络，气机失调，痰瘀内生，郁久化毒，损害筋骨关节，导致骨质侵蚀和骨质疏松。我院经临床实践总结认为，在RA病程中寒湿多、湿热少，肾阳虚多、肾阴虚少，痰瘀毒贯穿整个病程。我院以此理论开发出的乌龙丹制剂，由乌骨藤、穿山龙、秦艽、杜仲、白芍、川续断、木瓜、威灵仙组成。方中乌骨藤味微辛、涩，性温，归肝经，祛风湿、活血；穿山龙性平、味苦，归肝肺经，祛风除湿、活血通络。两药相合共奏祛风湿、活血通络之功效，为君药。臣以杜仲味甘、性温，归肝、肾经，补肝肾，强筋骨；川续断苦辛、微温，入肝、肾经，补肝肾，续筋骨，调血脉，共奏补肝肾、强筋骨之功效，助君药强筋骨除痹痛。佐以白芍养血、止痛、敛阴；木瓜舒筋活络、和胃化湿；秦艽祛风除湿、和血舒筋、清热；威灵仙祛风除湿、通络止痛。纵观全方散中有收、寓通于补、寒温得宜，共奏祛风除湿、补肾、通络止痛之功效。通过本实验我们发现，给予胶原诱导关节炎模型大鼠各剂量乌龙丹后，实验大鼠一般状况、关节炎指数积分及关节肿胀率均有不同程度的改善，其机制可能是通过调节关节滑液及血清中VEGF，阻断了滑膜血管新生、血管翳形成，从而抑制RA滑膜增生和关节破坏，这也可能是其取得临床疗效的机制之一。

5 参考文献

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[3]Wang CH，Yao H，Chen LN，et al.CD147 induces angiogenesis through a vascular endothelial growth factor and hypoxia-inducible transcription factor 1α-mediated pathway in rheumatoid arthritis[J].Arthritis & Rheumatism，2012，64（6）：1818-1827.

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