农杆菌介导小麦成熟胚遗传转化的几个影响因素研究

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摘要：为研究农杆菌介导的小麦成熟胚转化的影响因素，以2个小麦品种石4185、科麦一号的成熟胚为转化受体材料，分别以GV3101、EHA105、LBA4404等3种农杆菌菌株（含有pCAMBIA1380双元载体）为供体材料进行转化，主要检测成熟胚愈伤组织β-葡萄糖苷酸酶（GUS）报告基因的表达情况。结果表明，不同小麦品种对转化体系的反应各不相同，菌株、受体的基因型以及外植体的继代时间和生理状态等均对转化效率有很大的影响。GV3101的侵染转化效果优于另外2个菌株，石4185成熟胚愈伤对农杆菌侵染的敏感性比科麦一号要高。继代培养时间的延长会不同程度地影响小麦成熟胚愈伤的转化效果。通过对转化体系几个影响因素的研究，有助于提高农杆菌介导成熟胚转化体系的效率。

关键词：小麦；成熟胚；农杆菌；GUS表达率

中图分类号： S512.101文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）12-0045-03

lizhaowei79@163.com。小麦是世界三大粮食作物之一，种植较为广泛，一直占据着世界粮食产量的重要地位。近年来，通过分子改良的方法对其进行研究以缓解目前粮食短缺问题已逐渐成为研究重点[1]。在针对小麦的转基因研究中，基因枪法是应用最多的转化方法，但同时也存在试验成本高、转化效率较低以及外源基因容易存在多个拷贝等缺点[2-3]，相比较而言，利用农杆菌介导法进行小麦遗传转化则具有操作简单、成本较低、所转移基因拷贝数少、可转移较大DNA片段等优点，近年来已成为研究者关注的热点，成功获得了众多转化植株[4-8]。

农杆菌介导法转化小麦大多以幼胚作为外植体，可获得相对较高的诱导率和再生率，但是取材会面临诸多困难和限制；而以成熟胚作为外植体，具有取材便利、无气候与季节性影响、可保证不同个体间生理状况一致等优点，具有较高的研究价值[9-10]。小麦的基因组非常复杂，不同基因型之间遗传转化条件差异较大，转化体系的有效性及转化机制等诸多问题尚待解决。目前用农杆菌介导法进行小麦遗传转化的体系与玉米、水稻等单子叶植物相比仍然存在明显差距，而这种普遍较低的转化效率也制约了小麦基因工程改良的进一步发展[11-12]。本研究以小麦成熟胚为转化受体，针对菌株、基因型、愈伤培养时间等几个影响农杆菌转化小麦的重要因素进行比较和优化，为进一步提高侵染效果、改善农杆菌介导的小麦遗传转化体系提供参考。

1材料与方法

1.1植物材料

供试小麦品种为普通冬小麦品种石4185和科麦一号，均由笔者所在实验室保存。

1.2菌株及植物表达载体

农杆菌菌株为EHA105、GV3101和LBA4404；植物表达载体为pCAMBIA1380，该质粒T-DNA区带有由CaMV35S启动子驱动的β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因、潮霉素（HYG）基因。均由笔者所在实验室保存。

1.3方法

1.3.1种子灭菌与愈伤组织诱导选取無霉变的饱满种子，经75%乙醇消毒2 min，无菌水冲洗干净，用0.1%氯化汞消毒8～10 min，再用无菌水冲洗3次，置于适量无菌蒸馏水中，25 ℃避光浸泡16～18 h。在超净台中取出种子，小心剥离出胚，盾片向上置于诱导培养基（MS+2.0 mg/L 2，4-D+30 g/L 蔗糖+8 g/L琼脂，pH值5.8）上。置于培养箱中 25 ℃ 暗培养。愈伤诱导15 d后切去长出的芽，挑选长势良好的愈伤组织，去掉胚后转接入继代培养基（MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.4 g/L 2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES）+150 μmol/L 乙酰丁香酮+40 g/L麦芽糖+8 g/L琼脂，pH值5.8）。如有需要每20 d在相同培养基上继代1次。

1.3.2小麦愈伤的农杆菌侵染及共培养侵染前2～3 d挑取含重组质粒的农杆菌单菌落，接种于5 mL含有50 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，28 ℃、200 r/min 振荡培养过夜。再按1 ∶50的比例转接到含有相同抗生素的液体YEB培养基中，28 ℃、200 r/min振荡培养至D600 nm为0.6～0.8。离心收集菌体，重悬于侵染培养基（1/10MS+2.0 mg/L 2，4-D+400 mg/L MES+200 μmol/L乙酰丁香酮+40 g/L麦芽糖，pH值5.8）中，调整D600 nm为0.6。在超净台中选取淡黄色致密的愈伤组织，转入铺有灭菌纱布的培养皿中，倒入含有菌体的侵染培养基，将愈伤组织完全浸泡，室温侵染40 min。随后用灭菌纱布将愈伤组织托起并沥干液体，再将愈伤组织转移到铺有3层灭菌滤纸的培养皿中，置于24 ℃黑暗条件下共培养2～3 d。

1.3.3脱菌与抗性愈伤筛选将共培养后的愈伤组织移入灭菌培养瓶中，用脱菌液（MS+2.0 mg/L 2，4-D+40 g/L麦芽糖+500 mg/L特美汀）清洗3次，每次浸泡30 min，最后弃去脱菌液，将愈伤组织移至灭菌滤纸上，在超净台中干燥1 h。将愈伤组织转移到含有300 mg/L特美汀的继代培养基中，24 ℃ 黑暗恢复培养7 d。再将其转入筛选培养基（2.0 mg/L 2，4-D+50 mg/L潮霉素+300 mg/L特美汀+40 g/L麦芽糖+8 g/L琼脂）中，26 ℃黑暗条件下进行筛选培养。

1.3.4GUS染色GUS活性的组织化学染色检测，按 Jefferson 的方法[13]进行。待经过农杆菌转化的愈伤组织在含有潮霉素抗性的筛选培养基上筛选一段时间之后，每个小麦品种各挑取一部分抗性愈伤组织进行GUS表达检测。

1.3.5试验结果分析统计本研究中相应公式如下：

GUS表达率=（GUS表达受体组织块数/感染总受体组织块数）×100%；

抗性愈伤率=（抗性愈伤数/供试愈伤数）×100%。

2结果与分析

2.1不同农杆菌菌株对小麦成熟胚愈伤转化的影响

本研究分别采用携带表达载体的3种农杆菌菌株（EHA105、GV3101、LBA4404）对石4185和科麦一号的成熟胚愈伤组织进行侵染转化，经恢复培养7 d后转入含有潮霉素抗性的筛选培养基中，筛选一段时间之后，挑选抗性愈伤组织进行GUS基因检测。结果显示，3种农杆菌菌株对小麦成熟胚愈伤的侵染转化效果不同，EHA105和GV3101对愈伤的侵染效果要明显优于LBA4404（图1）。经EHA105和GV3101侵染转化的愈伤组织，在抗性筛选5 d之后，2个小麦品种的绝大部分愈伤组织呈现明显的蓝色。筛选20 d之后，愈伤组织GUS染色的面积明显缩小、颜色变淡，并且仅有部分愈伤组织表面可见GUS基因表达。筛选5 d时，GUS基因仍属于瞬时表达，此时呈现较深的蓝色，说明以35S启动的GUS基因在小麦愈伤组织细胞中得到了表达；筛选20 d时，不同处理中显示蓝色的部分均明显减弱且面积变小，此时GUS基因已经基本整合到植物基因组中。经LBA4404侵染转化的愈伤组织，抗性筛选5 d时GUS表达情况不强，整体染色较浅；而筛选至20 d时，大部分愈伤组织块已无明显GUS基因表达，说明此菌株对这2种小麦愈伤的侵染效果较差。

2.2不同基因型小麦成熟胚愈伤组织的转化效率比较

石4185和科麦一号这2个小麦品种经过不同农杆菌转化并经抗生素筛选20 d后，分别统计其愈伤组织的GUS表达率。图2结果表明，GV3101菌株对石4185的转化效果最好，GUS表达率达到64.3%；LBA4404菌株对这2种小麦成熟胚愈伤的侵染效果均较差，GUS表达率均不足30.0%，尤其是对科麦一号的转化，GUS表达率仅为16.0%；EHA105菌株的转化效果居中，并且对2种小麦的转化效果差异不大。

从图2还可以看出，石4185和科麦一号这2个小麦品种在相同农杆菌菌株及转化条件处理时的转化效率有所差异。石4185对3种农杆菌侵染的反应效果均不同，经GV3101菌株的侵染效果最佳，筛选20 d后的GUS表达率最高；经EHA105菌株侵染的效果居中，GUS表达率为42.8%；经LBA4404菌株侵染的效果最不敏感，GUS表达率为29.3%。3种农杆菌侵染石4185的表达率差异明显。科麦一号经EHA105、GV3101菌株的侵染转化效果差异不明显，GUS表达率分别为32.7%、31.0%；经LBA4404菌株侵染的效果最差，GUS表达率仅有16.0%。

2.3不同继代培养时间对小麦成熟胚愈伤转化的影响

在探索不同农杆菌菌株及不同基因型小麦在转化效率方面的差异之后，选取石4185作为受体材料，以GV3101为侵染菌株，进一步分析继代培养时间对成熟胚愈伤转化效率的影响。在试验中分别选取诱导后继代培养不同时间的愈伤组织，每个处理条件接种120～150个愈伤块进行试验，分别经农杆菌介导转化及潮霉素抗性筛选20 d后计算抗性愈伤的获得率，随后将抗性愈伤进行GUS染色分析并统计表达率。

表1结果显示，随着继代培养时间的延长，石4185愈伤的转化效果会受到一定的影响，培养时间不同，石4185的抗性愈伤率和GUS表达率在0.05水平存在着显著差异。在愈伤培养时间超过60 d后，抗性愈伤率和GUS表达率均随培养时间的延长而下降。随着培养时间的延长，GUS表达率比抗性愈伤率的下降程度更为明显。因此，针对本试验所采用的转化体系，在进行成熟胚愈伤的农杆菌侵染转化时，愈伤的继代培养时间不可过长，控制在2个月之内为好。

3结论与讨论

农杆菌介导法是目前植物上应用最为广泛的基因转化方法之一，自20世纪80年代出现以来，已经广泛应用于烟草、棉花、马铃薯等多种双子叶植物和玉米、水稻等一些单子叶植物中。自Cheng等首次利用农杆菌侵染获得转基因小麦以来[5]，近年来对其转化体系的研究已取得不少成果。为进一步提高转化效率，研究者在添加酚类物质、调整菌体浓度和侵染时间、选用高渗处理或表面活性剂、采用不同共培养方式等方面做过很多有效的探索和尝试。此外，菌株、受体基因型、外植体的类型、继代时间和生理状态等也被证实对转化效率具有很大的影响[2-4，11-15]。

研究者普遍认为，不同的农杆菌菌株对小麦外植体的侵染能力存在差别，即使对同一基因型的小麦侵染能力也不同[2-3，6，11]。本研究中3种菌株GV3101、EHA105和LBA4404介导的对小麦成熟胚愈伤的转化效果也体现出这一点。此外，从本研究可见，经EHA105侵染的愈伤在抗性筛选5 d时GUS染色的效果较GV3101侵染时要略深一些，但筛选20 d后却比GV3101表现要差一些。其原因是在筛选5 d时，GUS基因尚属瞬时表达，EHA105的瞬时转化效果更好，很可能是由于该菌株侵染毒力强；而在筛选20 d时，绝大多数显示GUS染色阳性的愈伤组织已经是稳定表达，而GV3101的稳定转化效果要强于EHA105。同时，本研究发现，LBA4404的转化效果不佳，可能是由于与EHA105、GV3101的侵染毒性相比，LBA4404更为温和。但也有研究显示，LBA4404溫和的侵染毒性更适于进行转化[2]。而多数研究者的研究结果显示，侵染毒性较强的农杆菌菌株对小麦的转化效果较好。

在农杆菌介导小麦的遗传转化中，不同基因型小麦之间也存在对农杆菌敏感性的明显差异。从本研究可见，利用3种菌株进行侵染时，石4185的敏感性均优于科麦一号，尤其对GV3101的敏感性最强，GUS表达率最高。因此，小麦基因型之间的差别，不仅是愈伤再生体系方面的主要影响因素，同时也对遗传转化效率具有重要影响，这也是小麦复杂性的又一体现[2-4，11，14]。本研究将不同小麦基因型与不同农杆菌菌株对转化效率的影响结合起来进行对比研究，对于小麦转基因育种水平的提高具有一定的现实意义。

虽然GUS表达率并不能完全代表小麦农杆菌侵染的最终转化效率，但可以作为一项重要的参考指标。以往研究显示，能够检测出GUS基因表达的受体，分化再生之后对其进行PCR检测，一般也能够检测出目的基因；而即使GUS基因无表达时，目的基因也并非一定没有转化成功，可能是GUS基因表达很弱，肉眼观察不到所致[16]。因此在本研究中选用这样一项简单直观的报告基因来进行转化体系效率的分析，可以直观地了解到转化体系的效果。

综上所述，不同的农杆菌菌株对小麦的侵染转化效果不同；同一菌株对不同基因型小麦的侵染能力也不同。因此利用农杆菌介导法进行小麦转基因研究时，应当针对具体所用的外植体状态，采用适宜菌株，探索最佳转化条件，才能获得较高的转化效率。

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