南方红豆杉MCT基因克隆、功能验证及组织表达特异性检测

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摘要：【目的】克隆南方红豆杉的2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶（MCT）基因（TcMCT），分析其功能，并检测组织表达特异性，为深入研究TcMCT基因在紫杉醇生物合成中的作用机制提供理论依据。【方法】采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术获得TcMCT基因的cDNA全长序列，对其编码蛋白进行生物信息学分析及亚细胞定位，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测TcMCT基因的组织表达模式，并在大肠杆菌中超表达该基因以验证其功能。【结果】克隆获得的TcMCT基因cDNA序列全长为1293 bp，开放阅读框（ORF）为942 bp，编码313个氨基酸。TcMCT蛋白与其他植物MCT蛋白中均含保守的MEP结合位点和CTP结合位点，但在N端氨基酸序列保守性较差，其中与同为裸子植物银杏GbMCT蛋白的亲缘关系最近，氨基酸序列的相似性为59.3%。TcMCT蛋白的三级结构与AtMCT蛋白相似，均属于同源二聚体。TcMCT蛋白N端含84个氨基酸残基的质体转运肽，且以Arg88作为切割位点，定位于叶绿体中。TcMCT基因在南方红豆杉不同组织中均有表达，在绿色树皮中的相对表达量显著高于其他组织（P<0.05，下同），且在老叶和嫩叶中的相对表达量显著高于茎和根，在茎和根中的表达量极少甚至不表达。大肠杆菌中超表达TcMCT基因可促进β-胡萝卜素大量积累。【结论】不同物种MCT氨基酸序列具有较高的保守性，TcMCT基因具有明显的组织表达特异性，可调控萜类物质如β-胡萝卜素等的生物合成，推测其在紫杉醇生物合成中发挥重要调控作用。

关键词： 南方红豆杉;2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶（MCT）;生物信息学分析;功能验证;紫杉醇

0 引言

【研究意义】南方红豆杉（Taxus chinensis）为我国特有种，其树形美观，木质优良，富含紫杉醇，是罕见的一树三用树种（吴继刚，2015）。临床研究发现，紫杉醇在治疗乳腺癌、卵巢癌和肺癌等方面疗效显著，是一种高效新型的抗癌药物（Armstrong et al.，2006;Miller et al.，2007;Rezazadeh et al.，2016;Oudin et al.，2017）。此外，紫杉醇可提高植物抵抗真菌的能力（Soliman et al.，2015）。异戊烯焦磷酸（IPP）是紫杉醇、胡萝卜素等萜类化合物生物合成的重要前体物质，而2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶（MCT）不仅是参与IPP合成的关键酶，还是萜类物质生物合成MEP途径中的关键酶之一（Rohdich et al.，1999;Croteau et al.，2006）。因此，克隆TcMCT基因，并分析其生物学功能，对提高红豆杉紫杉醇含量具有重要意义，同时可为南方红豆杉分子育种提供理论依据。【前人研究进展】MCT参与4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖醇（CDP-ME）的合成。Rohdich等（1999）将带有14C标记的CDP-ME转入辣椒，结果发现带有14C标记的CDP-ME在辣椒质体中参与类胡萝卜素生物合成，说明MCT在萜类化合物生物合成过程中发挥重要作用。迄今为止，已从拟南芥（Rohdich et al.，2000）、杜仲（刘攀峰，2012）、胡黄连（郑玉娟等，2014）、雷公藤（董宇茹等，2015;宋雅迪等，2018）、青蒿（张曼等，2016）和卷叶贝母（张甜甜等，2018）等被子植物中克隆获得MCT基因，但关于其功能鉴定的研究报道较少。Rohdich等（2000）研究发现，拟南芥AtMCT蛋白的N端含有质体转运肽序列，与MEP途径定位于质体相吻合，通过抑制AtMCT基因的表达能下调贝壳杉烯的生物合成。董宇茹等（2015）、宋雅迪等（2018）研究发现，雷公藤TwMCT基因属于MCT基因家族成员，且受茉莉酸甲酯（MeJA）诱导表达，通过RNAi技术抑制雷公藤TwMCT基因表达后，植株中的雷公藤甲素和雷公藤红素含量显著下降。张曼等（2016）从青蒿中克隆获得AaMCT基因cDNA序列，该基因编码蛋白定位于叶绿体中，且在青蒿分泌型腺体中特异性表達，将其转入拟南芥中超表达后能显著促进叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素等萜类化合物合成。由此可见，在被子植物中，不同物种的MCT基因均对萜类化合物合成具有重要调控作用。目前，在裸子植物中仅银杏MCT基因的相关研究被报道。Kim等（2006）首次从银杏中克隆得到GbMCT基因，并通过烟草细胞叶绿体荧光染色试验证明GbMCT蛋白N端含88个氨基酸的质体转运肽。【本研究切入点】至今，鲜见有关南方红豆杉中紫杉醇生物合成途径中关键酶基因MCT的研究报道。【拟解决的关键问题】采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术从南方红豆杉中克隆TcMCT基因的cDNA序列全长，对其进行生物信息学分析，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测其组织表达特性，并在大肠杆菌中超表达该基因以验证其功能，以期从分子水平探讨MCT基因在萜类化合物合成中的作用，为紫杉醇生物合成研究提供候选功能基因。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试的3株南方红豆杉均由西南大学实验基地提供，树龄为4年，长势基本一致，由西藏农牧学院兰小中教授鉴定为T. media Rehd. var. mairei Lemee et Levl。本氏烟草种子、大肠杆菌DH5α和XL1-Blue均由西南大学生命科学学院实验室保存提供。pAC-BETA和pTrc-AtIPI质粒由马里兰大学的Francis X Cunningham博士惠赠。主要试剂：植物RNA提取试剂盒和FastQuant cDNA第一链合成试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司，BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit购自美国CLONTECH公司;RNA PCR Kit（AMV） Ver.3.0、3"-Full RACE Core Set试剂盒和SYBR Premix Ex Taq II（Perfect Real Time）购于日本TaKaRa公司。主要仪器设备：Centrifuge 5417R冷冻离心机（Eppendorf，德国）、DYY-8C电泳仪（北京市六一仪器厂）、梯度PCR仪（Bio-Rad，美国）和LSM700激光共聚焦显微镜（ZEISS，德国）等。