黄芪多糖口服吸收促进剂的研究

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[摘要] 该实验利用黄芪多糖中引入的仲氨基与FITC中氰基发生亲核反应，得到FITC荧光标记的黄芪多糖，并采用Caco-2细胞模型评价了低相对分子质量壳聚糖和鱼精蛋白对黄芪多糖的吸收促进作用。结果表明该荧光标记方法稳定性好，灵敏度高；低相对分子质量壳聚糖和鱼精蛋白对细胞毒性作用均较小；2种吸收促进剂对黄芪多糖的吸收均具有一定的促进作用，同时吸收促进剂的比例越大时，作用越明显，低相对分子质量壳聚糖的作用略强于鱼精蛋白。实验前后细胞跨膜电阻（TEER）的变化表明其作用机制可能是吸收促进剂能暂时打开细胞间的紧密连接，增加了膜的流动性，从而提高药物的透过性。

[关键词] 黄芪多糖；FITC；Caco-2细胞模型；吸收促进剂

黄芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）是中药黄芪的主要生物活性成分，其药理作用十分广泛，具有增强机体免疫功能、强心、抗病毒、抗肿瘤、调节血压、抗衰老、抗氧化延缓衰老等作用^[1-4]。黄芪多糖主要是由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖等重复单元连接而成，属于水溶性物质^[5]，其中相对分子质量在10 000～50 000的活性最强，由于黄芪多糖属于生物大分子，且亲水性强，因而其生物透膜性差，口服生物利用度较低^[6-7]。

采用吸收促进剂提高药物的生物利用度是常用且有效的手段，吸收促进剂的种类繁多，但大多数吸收促进剂的作用与其细胞毒性高度相关，不能应用于肠道^[8]。本实验选择了2种低毒而有效的吸收促进剂壳聚糖（CS）和鱼精蛋白（PS），研究其对黄芪多糖的吸收促进作用。Caco-2细胞模型是被国内外广泛应用并被认可的体外吸收模型。由于在吸收过程研究中比较简单、重复性好，目前正被广泛应用于评估药物的细胞渗透性、阐明药物转运的途径等研究中^[9-11]。本实验采用Caco-2细胞模型研究2种吸收促进剂对黄芪多糖的吸收促进作用，从而为黄芪多糖的口服制剂的研究和发展提供实验基础。

1材料

二氧化碳培养箱（美国Nuaire公司）；XDS-1B倒置显微镜（重庆）；Millicell-ERS跨膜电阻仪，Milli-Q纯水机（美国Millipore公司）；Transwell 培养板（丹麦NUNC公司）；高速冷冻离心机（美国Beckman公司）；F96S荧光分光光度计（上海棱光技术有限公司）。

Caco-2 细胞由美国胡明博士馈赠；DMEM 培养基（美国 Hyclone公司）；胎牛血清（美国 Equitech-Bio公司）；非必需氨基酸（美国JRH公司）；异硫氰酸荧光素（FITC），谷氨酰胺，胰蛋白酶，酪胺（美国Sigma公司）；硼氢化钠（国药集团化学试剂有限公司）；Hank′s缓冲盐溶液（HBSS ）和磷酸盐缓冲溶液（PBS）均自配；黄芪多糖（实验室自制，纯度92.3%）；壳聚糖（CS，相对分子质量30 000，浙江金壳生物化学有限公司）；鱼精蛋白（PS，德瑞生物科技有限公司）；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1黄芪多糖的荧光标记

2.1.1APS-Tyr的合成 取APS 200 mg溶于20 mL 0.2 mol·L^-1的磷酸钾缓冲液（pH 8.0），加入酪胺（Tyr）200 mg，室温下反应24 h。然后加入硼氰化钠100 mg，于37 ℃水浴中反应96 h，间或振荡，反应完毕后。离心分离，将其上清液上Sephadex G-25柱。用水洗脱，在280 nm下检测收集的第一峰。冻干后得多糖和酪胺的合成产物APS-Tyr。

经Sephadex G-25分子筛色谱柱分离，在280 nm 波长处检测各管样品的吸光度，见图1，APS在280 nm 波长处无特征吸收峰存在，而Tyr在280 nm 波长处有特征吸收峰，同时第1个峰用苯酚硫酸法测得有糖存在，而第2个峰无糖存在，初步证明第1个峰既有APS又有Tyr存在，而第2个峰只含有Tyr，说明合成的APS-Tyr 首先出峰，未与SEP 结合的酪胺在其后出峰，APS-Tyr得到纯化。

2.1.2APS-Tyr-FITC的合成^[12-13] 取APS-Tyr 200 mg溶于适量水中，用0.5 mol·L^-1 NaHCO3调pH至8.5，然后加入FITC 20 mg，于室温下避光反应过夜，向反应物中加入适量无水乙醇至乙醇终浓度为80%，有大量亮黄绿色沉淀析出，离心，弃去上清液，沉淀加水复溶，乙醇再沉淀，按照此操作重复3次，最后一次沉淀用少量水溶解，进一步上 Sephadex G-25柱纯化，收集相应水洗脱的组分，冻干保存得APS-Tyr-FITC。经FITC标记的APS-Tyr-FITC为橙红色粉末，其水溶液呈明显的黄绿色荧光。

经Sephadex G-25分子筛色谱柱分离，用荧光分光光度仪在激发波长495 nm，发射波长510 nm处检测各管样品的荧光吸收强度，见图2，APS在该波长处无特征吸收峰存在，而FITC在该处有特征吸收峰，第一个峰用苯酚硫酸法测得有糖存在，而第二个峰无糖存在，表明收集的第一峰产物APS 又有FITC存在，而其后的峰为游离的FITC。

FITC为荧光免疫分析中常见的荧光探针之一，首先在氰基的存在下，APS与酪胺发生还原氨化反应，引入仲氨基，在弱碱性条件下，该仲氨基可与FITC 的异硫氰酸中氰基发生亲核反应，生成APS-Tyr-FITC。该方法可以避免在反应过程对APS内部结构的破坏，同时能够更好地保持糖原有的生物活性。该方法合成荧光探针，可用于相应糖的生理、生化、药理、药物代谢等多方面的基础研究，也能被进一步用于相关疾病的诊断。

2.2APS-Tyr-FITC测定方法

用荧光分光光度仪测定APS-Tyr-FITC的浓度，测定条件为激发波长495 nm，发射波长510 nm。

2.3供试品溶液的配制

分别称取制备的APS-Tyr-FITC 3.0 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，用HBSS缓冲液定容至刻度，即得APS-Tyr-FITC贮备液。按照APS-Tyr-FITC-鱼精蛋白1∶1，1∶3的比例分别称取鱼精蛋白3.0，9.0 mg，加入上述贮备液中，得不同比例的APS-Tyr-FITC+鱼精蛋白供试品溶液。同法制备APS-Tyr-FITC + 壳聚糖供试品溶液。

2.4标准曲线的制备

精密称取制备的APS-Tyr-FITC 3.05 mg，置于10 mL量瓶中，用HBSS 缓冲液定容至刻度，得质量浓度为305.00 mg·L^-1的APS-Tyr-FITC溶液。分别精密吸取该溶液0.1，0.5，1.0，2.5，4.0，5.0，7.5 mL至10 mL量瓶中，用HBSS缓冲液稀释并定容，摇匀，用荧光分光光度仪测定吸光度。以浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，进行线性回归，得标准曲线回归方程A=0.168 1X-0.014 8，R²=0.999 4，结果表明，APS-Tyr-FITC在该浓度范围内线性关系良好。

2.5细胞的培养

将Caco-2细胞培养于含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸（NEAA），1%谷氨酰胺（L-glutamine），青霉素（100 U·mL^-1）-链霉素（100 mg·L^-1）双抗液的 DMEM培养基中，在温度37 ℃、相对湿度90%的5%CO₂恒温培养箱中培养。待生长至一定数量后，以1×10⁵ mL^-1的密度接种于Transwell 6孔板中继续静置培养，每天更换一次培养液，直至形成完全致密的单层（约21 d） 。用跨膜电阻测定方法判断细胞是否形成完整的单层。当单层细胞跨膜电阻值（TEER）大于300 Ω·cm-2时，即符合实验要求可用于通透试验。当Caco-2 细胞在聚碳酯膜上生长21 d以上，其各孔的TEER已大于300 Ω·cm-2，且趋于恒定，可用于转运试验。

2.6细胞毒性试验

将Caco-2细胞悬液接种于灭菌处理的96孔板中，每孔加100 μL，于5%CO₂，37 ℃培养箱中培养24 h。取出，吸弃孔内原培养液，加入不含胎牛血清的培养基90 μL，再加入含不同浓度药物的HBSS溶液、空白的HBSS溶液（空白对照组） 10 μL。然后移入细胞培养箱继续培养24 h。每个药物浓度设6个平行复孔，到时间吸弃孔内原培养液，加入不含胎牛血清的培养基100 μL，然后每孔再加入5 g·L^-1 MTT 溶液10 μL，继续培养4 h后，取出，小心吸弃孔内上清液，每孔加二甲基亚砜（DMSO） 100 μL，在微量振荡仪振荡10 min，使结晶充分溶解，用酶标仪测定吸光度，检测波长为550 nm，参比波长为690 nm。根据吸光度计算细胞存活率，结果见表1。本实验中所用的药物以及吸收促进剂的浓度对细胞无明显的毒性，可用于转运试验的研究。

2.7转运试验

取生长状态良好的Caco-2 细胞转运板，37 ℃预热的HBSS溶液洗涤AP侧和BL侧各3次，测TEER以确定单层细胞的紧密性与完整性，符合要求者放置于37 ℃，50 r·min^-1摇床孵育30 min，吸弃AP侧和BL侧的HBSS溶液，根据实验设计，对于药物从细胞绒毛面AP侧到基底面BL侧的转运，在AP侧加入含有受试药物的HBSS缓冲液2.5 mL，作为供给液，在BL侧加入空白HBSS缓冲液2.5 mL，作为接收液，对于药物从BL侧到AP侧的转运，将含有受试药物的HBSS缓冲液2.5 mL加到B侧作为供给液，空白的HBSS溶液2.5 mL加到A侧作为接收液。加完后立即将Transwell培养板置于恒温恒速的摇床（37 ℃，50 r·min^-1）中温孵，分别在0，1，2，3，4 h精密吸取供给池、接收池溶液各400 μL，同时补加相应的溶液，每组平行3 孔。

2.8统计学处理

药物表观通透系数Papp的大小反应了药物透过单层细胞的能力以及药物吸收的速度和程度。Papp=（dQ/dt）/（S×C），式中，dQ/dt为接收池药物出现的速率，S为膜面积（4.2 cm²），C为药物的初始浓度。Papp越大，表明其通透率越高。不同比例的吸收促进剂对APS-Tyr-FITC表观渗透系数Papp的影响见表2。

结果显示，APS-Tyr-FITC的表观渗透系数较低，因此其肠吸收较差。这可能是由于APS-Tyr-FITC为亲水性大分子，不易穿过细胞膜的脂质双层膜。同时APS-Tyr-FITC A到B侧的渗透系数与B到A侧的渗透系数相当，表明其在吸收过程中可能不是通过某个特定的载体介导转运的，同时也说明可能不存在药物的外排，表明药物的吸收可能是以被动扩散过程为主。鱼精蛋白和低相对分子质量壳聚糖对APS-Tyr-FITC的吸收均有促进作用，低相对分子质量壳聚糖的作用稍强于鱼精蛋白。根据实验前后TEER的变化，提示其作用机制可能是吸收促进剂能暂时打开细胞间的紧密连接，改变了细胞膜的结构，增加了膜的流动性，从而提高药物的透过性^[14]。实验前后TEER的变化见表3。

3讨论

传统的苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法由于灵敏度较低，不适用于多糖的微量测定。同时生物体内存在的大量内源性相似多糖的干扰，也给该类药物的分析检测带来了较大的困难^[15]。使用荧光物质对多糖进行标记，再利用荧光基团有激发和发射波长的特点进行定量检测多糖是目前研究多糖较为常用的方法。FITC具有较好的光稳定性和灵敏度，为荧光免疫分析中常见的荧光探针之一。

药物生物利用度低是临床用药的首要问题，其中极性大、脂溶性差或大分子药物较难透过生物膜，常需添加吸收促进剂改善其吸收。口服吸收促进剂种类较多，包括生物黏附性高分子、脂酸和表面活性剂等。壳聚糖安全性高，生物黏附性好，为常用的吸收促进剂。鱼精蛋白是一种碱性蛋白，主要存在于各类雄性动物成熟精巢组织中，它主要是以与DNA 结合的核精蛋白形式存在。安全无毒、无副作用。目前其主要应用于食品的抗菌防腐以及在心内直视术中拮抗肝素。

本实验利用多糖中引入的仲氨基与FITC中氰基发生亲核反应，生成APS-Tyr-FITC，从而引入荧光基团，进行黄芪多糖在Caco-2细胞模型上的吸收促进剂的研究。本实验中使用的低相对分子质量壳聚糖和鱼精蛋白对黄芪多糖的吸收均有一定的促进作用，且这2种辅料对细胞毒性作用较小，安全性好，这启发研究者利用吸收促进剂可以提高口服黄芪多糖的跨膜转运，为进一步研究的黄芪多糖口服制剂提供了一定的参考。

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Study on oral absorption enhancers of Astragalus polysaccharides

CHEN Xiao-yun1，2， TAN Xiao-bin¹， SUN E¹， LIU Dan¹， JIA Xiao-bin 1，2 *， ZHANG Zhen-hai1*

（1.Key Laboratory of New Drug Delivery System of Chinese Materia Medica， Jiangsu Provincial Academy of

Chinese Medicine， Nanjing 210028， China；

2. Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210046， China）

[Abstract] Astragalus polysaccharides was lounded to 4-（2-aminoethylphenol）， followed by labeling the APS-Tyr with fluorescein-5-isothiocyanate （FITC） at the secondary amino group.The absorption enhancement effects of low molecular weight chitosan and protamine on astragalus polysaccharides were evaluated via Caco-2 cell culture model. The results show that the fluorecent labeling compound has good stability and high sensitivity. On the other hand low molecular weight chitosan and protamine also can promoted absorption of the astragalus polysaccharides without any cytotoxity，and the absorption increase was more significant with increasing the amount of low molecular weight chitosan and protamine. At the same time，the low molecular weight chitosan has slightly better effect. The transepithelial electric resistance （TEER） of Caco-2 cells show that absorption enhancers could improve its membrane transport permeability by opening tight junctions between cells and increasing the cell membrane fluidity.

[Key words] Astragalus polysaccharides； FITC； Caco-2 cell model； absorption enhancers

doi：10.4268/cjcmm20140719