心力衰竭病人β受体信号相关通路改变

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【摘要】目的:探讨心衰病人心肌组织β1、β2、β3受体mRNA表达的变化及其与相关信号通路的关系。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)方法检测24例瓣膜置换术的心衰病人和5例健康对照者心肌组织β1、β2、β3受体mRNA表达。用化学法和放免法测定心肌一氧化氮合酶(NOS)、诱导型NOS(iNOS)、环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)的变化。结果:心衰时心肌β3受体mRNA表达下调、cAMP生成减少;β1受体上调、NOS活性增加和cGMP生成增多,β1受体下调和β3受体上调均与心衰严重程度有关,β2受体表达无改变。结论:心衰时心脏β受体信号通路中包括β受体mRNA、cAMP、cGMP、NOS等多个环节发生改变,且改变程度与心功能相关。

关键词:心力衰竭;心肌;β肾上腺素受体;信号通路

中图分类号:R692.3 文喊标识码: A 文献编号:1671-4954(2010)04-242-05

doi:10.3969/j.issn.1671-4954.2010.04.004

肾上腺素能受体(β受体)-鸟苷酸调节蛋白(G蛋白)-腺苷酸环化酶(AC)系统是心肌受体信息的传递系统,对心肌的变力和变时的调控具有重要作用。目前已知心脏存在的β1、β2 、β3,三种β受体都通过与 G蛋白偶联而发挥作用。β受体经过G蛋白与AC偶联,形成复合体,此为交感跨膜信号传递途径的分子结构基础。

业已确认,β受体信号转导系统的改变对心衰的发生和发展以及临床治疗均有重要的意义。本文通过检测心衰患者心肌组织β受体mRNA表达及相关信号通路如NOS、iNOS、cAMP和cGMP的变化及其相关性来研究β受体信号通路与心衰的关系。

1资料与方法

1.1 研究对象

1.1.1因瓣膜性心脏病接受瓣膜置换术的心衰病人24例,男10例,女14例,年龄46.25+12.64岁;心功能Ⅱ级6例,Ⅲ级13例,Ⅳ级5例。

1.1.2正常对照组5例,来自意外伤亡的器官捐献者。

1.2 研究方法

1.2.1 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测心肌组织β1、β2、β3受体受体表达。

1.2.1.1 标本收集二尖瓣置换术的心衰病人手术中取黄豆大小左室乳头肌数块,意外伤亡者于死亡后立即取出心肌标本冷藏,4小时内取左室乳头肌数块,立即置入液氮中冷冻保存用于RT-PCR检测。

1.2.1.2 总RNA提取心肌组织50mg放人加有 l mlTrizol(上海生工)分离液的1.5ml EP管中,按说明书操作步骤提取总RNA,RNA样品纯度用OD260/OD280来衡量,本实验RNA样品的OD260/OD280在1.992～2.032之间,符合RNA样品纯度的要求。

1.2.1.3逆转录(RT)反应取总RNA21～μl(5μg)加 随机引物oligo(dT)21μl,70℃水浴变性5min后,冰 浴5min,依次加入下列试剂:dNTP2.5μl、5xbuffer4μl、RN A酶抑制剂1μl、AMV逆转录酶(Promege公司)3μl、DEPC处理的灭菌水5.5μl。混匀,置42℃反应60min,逆转录结束后,取出反应管于95℃变性5min,4℃10min,再保存于-20℃备PCR扩增反应用。

1.2.1.4聚合酶链反应 (PCR)建立50μl的扩增反应体系,依次加入下列试剂 :cDNA6μl、10xbuffer 4.5μl、lO mM dNTPs 1μl、上游引物(0.25μmoll/L)1μl 、下游引物 (0.25μmol/L)1μl、Taq DNA聚合酶lμl、DEPC处理水35.5μl。混匀后置 PCR仪,扩增条件如下:94℃预变性3min,94℃变性45s,退火(温度见表1)45s,72℃延伸1min,共循环35次;最后在72℃延伸10min,取出反应管置4℃10min,即可进行电泳。β-actin基因不受疾病及药物等因素的影响,表达稳定,选用β-actin基因为内对照,以消除上样等因素造成的误差。引物由广东心血管病研究所余细勇教授惠赠,dNTPs、Taq DNA聚合酶购自上海生工。(见表1)

1.2.1.5 RT-PCR产物电泳分析 制1.5%琼脂糖凝胶加入溴化乙锭,RT-PCR产物及 Marker各10μl分别上样电泳停止后,凝胶成像系统(美国AlphaInnotech公司chemilmager 5500型)分析处理,计算β受体mRNA与β-actin mRNA的灰度比值。

1.2.2放免法测定心肌组织环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)含量。

1.2.2.1 心肌组织处理 取组织50mg左右放入盛有2ml冷的50mM醋酸缓冲液的pH4.75试管内(放人冰浴),用匀浆器将组织粉碎后的悬浮液人10ml试管内,用2ml 无水乙醇洗匀浆器然后将乙醇倒入悬浮液内混匀静置5min,3000rpm离心15min,将上清液收集在青霉素小瓶内,再用75%乙醇lml洗匀浆器连续两次,用该2ml75%乙醇洗沉淀混匀3500rpm离心15min,合并上清液6O℃水浴中吹干。

单位:pmol/mg。

1.2.2.2试剂盒购自上海中医药大学同位素室,按说明书操作。

1.2.3化学法测定心肌组织一氧化氮合酶(NOS)和诱导型iNOS测定。

1.2.3.1心肌组织匀浆制备取心肌组织约0.15g加9倍的生理盐水1.35ml制备成10%的组织匀浆,3000rpm离心10min,取上清50μl测定 NOS活力,另取50μl测蛋白含量。

1.2.3.2蛋白含量测定方法 用紫外光谱吸收法测定蛋白含量,紫外分光光度计(UV2201型)测得样品A约在1.7～1.9范围内,表明样品是相对纯化、无核酸污染的蛋白溶液。用以下经验公式估算出蛋白质含量:蛋白质浓度(mg/m1)=1.45×A280mm-0.74×A260mm。

1.2.3.3 试剂盒购自南京建成生物工程公司,按说明书操作。

1.3 统计学处理

数据以均数±标准差(χ±s)表示,组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,采用SPSS 11.0软件包进行统计。

2 结果

2.1 RT～PCR法检测心肌组织β受体 mRNA表达结果 (表2)

心衰病人β1受体mRNA表达减少,其减少程度与心衰严重程度相关(图1);心衰病人β2受体mRNA有表达,不同程度心衰病人之间改变无显著性差异(图2);心衰病人β3,受体 mRNA表达增多,心衰程度越重表达越多 (图3)。

2.2

心肌组织NOS和iNOS的变化心衰病人心肌组织NOS、iNOS较正常人明显增高(P<0.01),心衰程度越重,其含量越多(表3)。

2.3

心肌组织cAMP和cGMP的变化心衰病人心肌组织中cAMP明显降低(P<0.01)随心衰加重其含量越少;而心肌组织cGMP含量明显增高 (P<0.01),心衰程度越重,其含量越多 (表4)

2.4 β受体mRNA表达量与相关信号通路的相关性

相关分析表明:心肌组织β1受体mRNA表达与心肌cAMP呈正相关,而与NOS、iNOS、和cGMP呈负相关(P<0.01);β2受体 mRNA表达与心肌中含量无相关性;而β3受体mRNA与心肌cGMP呈负相关,和心肌中NOS、iNOS、和cGMP呈正相关(P<0.01)(表5)。

3 讨论

3.1慢性心衰时β受体相关信号通路变化与心功能的关系

心脏β1受体激活后与Gs 蛋白偶联,通过激活细胞膜上的A C使细胞内cAMP水平升高,Ca内流增加,心肌收缩力增强。以往认为心脏β2受体与β1受体同样是与Gs蛋白偶联的,通过Gs-AC-cAMP信号途径介导心肌正性变力效应,近来研究发现β2受体同时与Gs、Gi蛋白相偶联,Gi通路对Gs通路信号向细胞内的转导发挥屏蔽作用,而使β2受体信号转导具有空间局限性,提示了功能性 cAMP局域化和由β2受体偶联Gi信号转导通路的存在[1]。β3受体可介导负性肌力作用,其负性肌力作用能够被百日咳毒素、NO的非特异性阻断剂甲基蓝及以NOS的抑制剂亚硝基左旋精氨酸甲酯等阻断,NOS的底物 L-精氨酸可逆转阻断剂的作用。此外,β3受体激动剂的负性变力效应与NO、cGMP的产生相平行,表明β3受体的信号通路可能是通过Gi-NO-cGMP通路转导[2]。

本研究表明心衰病人心肌组织β1受体mRNA表达减少和cAMP生成减少,心衰程度越重表达越少;β3受体mRNA增多,NOS活性增高,cGMP生成增多,与心衰程度呈正相关。可见,慢性心衰时,β受体复合体的每一成员,包括β受体、G蛋白、AC及环核苷酸等可能都有功能减退,而且β受体激动药与β受体的亲和力、受体与 G蛋白的偶联、G蛋白与效应酶间的相互作用都会发生异常变化。

3.2慢性心衰时β肾上腺素能信号转导系统改变的机理

心衰病人最普遍的受体异常是β1受体下调,晚近发现还存在β3受体上调[3]。本研究发现β1受体下调及β3受体上调的程度分别与心衰的严重程度呈负、正相关。β1受体下调的机制 目前认为主要与衰竭心肌受体蛋白在转录水平发生障碍有关,因发现多种心衰动物和人心肌细胞内β1受体mRNA水平降低。与β1受体不同,β2受体不存在下调。正常情况下心脏β3受体含量相对较少,衰竭心肌β3受体并不下调反而含量明显增多,其机制尚不清楚,可能是β3受体对短期激动剂诱导的未偶联信号途径不敏感,可抵抗长期下调,也可能β3受体含量增加仅仅是心室受损的结果[4]。

心肌细胞的主要信号转导通路之一是 AC-cAM路径,其中cAMP与cGMP在心脏发挥着相反的功能作用,cAMP与心脏功能正相关,cGMP与心脏功能负相关[5]。研究发现衰竭心肌的细胞膜AC活性在基础状态下及鸟苷酸刺激下均降低,cAMP净生成减少约40%[6]。本研究也发现衰竭心肌cAMP含量明显降低,且随着心衰程度加重而降低;cGMP含量增高并且随着心衰程度加重而呈上升趋势。cGMP可激活促进 cAMP降解的磷酸二酯酶,使 cAMP水平更加下降而增加负性肌力作用[7]。因此,衰竭心肌通过β1受体下调使cAMP依赖性正性肌力效应明显减弱。目前认为cAMP下降可能有两方面作用:一是心肌收缩力下降,使衰竭心肌功能进一步恶化;二是降低处于能量饥饿状态的心肌能量消耗,保存心肌细胞活力,可能有助于延缓心衰恶化[8]。心肌内cAMP升高可致正性频率和正性肌力作用,儿茶酚胺的正性肌力和频率增加作用是由心肌细胞中的β1和β2受体介导的,而β3受体的作用与其相反。在人的心室肌,β3受体与Gi蛋白相偶连,刺激NOS,导致NO产生,细胞内cGMP增加,心肌收缩力降低,衰竭心脏产生的正性肌力作用比非衰竭心脏减少75%[3]。动物实验表明β3受体激动剂BRL-37344可使豚鼠左室压、钙离子流均降低,同时发现 NOS抑制剂L-N- AME可减弱BRL-37344负性肌力作用,提示β3受体产生的负性肌力作用,部分通过钙离子流下降,部分通过NO依赖途径实现的[9]。

此外,慢性心衰时亦存在β受体与Gs蛋白脱偶联,β1和β2受体都可发生脱偶联现象,β3受体不包含β受体激酶磷酸化位点,还缺少PK A调节磷酸化的序列,缺乏象β1/β2受体那样激动剂诱导快速减敏的化学结构,它的激活需要比β1、β2受体激活浓度更高的儿茶酚胺量[10]。因此β3受体不易发生脱敏功能活性不会减退。β3受体与Gi蛋白偶联,心衰时β3受体含量增加,也许可以在某些程度上解释Gi蛋白的增加。二者的偶联刺激 NOS,导致 NO产生,细胞内cGMP增加,使心肌收缩力降低。

综上所述,心衰时心脏β受体及相关信号转导通路存在明显改变,主要表现为β1受体mRNA和cAMP生成减少;β3受体上调,NOS活性增加和cGMP生成增多,β1受体下调和β3受体上调均与心衰严重程度有关,β2受体表达无改变。

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