斑节对虾金属硫蛋白全基因DNA克隆及生物学信息分析

摘要：为深入研究斑节对虾（Penaeus monodon）金属硫蛋白MT（Pm-MT）基因参与斑节对虾性腺发育调控的分子机制，根据Pm-MT基因的cDNA序列，利用普通PCR和染色体步移（Genome Walking）技术获得Pm-MT基因的DNA全长序列，该基因序列DNA全长为2 744 bp，由2个内含子和3个外显子组成。其中启动子区域为806 bp，2个内含子长度分别为1 194、242 bp，3个外显子长度分别为22、78、77 bp。在启动子区域预测到转录因子糖皮质激素应答元件和雌激素应答元件与卵巢发育密切相关。

关键词：斑节对虾（Penaeus monodon）；金属硫蛋白；全基因DNA克隆；生物信息学分析

中图分类号：S945.4+7；Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）03-0575-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.03.047

Cloning and Bioinformatic Analysis of Metallothionein Gene DNA

Sequence in Penaeus monodon

ZHOU Fa-lin， ZHENG Li-ming， YANG Qi-bin， HUANG Jian-hua， YANG Li-shi， JIANG Shi-gui

（South China Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Guangzhou 510300， China）

Abstract： For further research on the molecular mechanism of Penaeus monodon MT （Pm-MT） involved in Gonadal development regulation，the PCR and genome walking technology was used to obtain the full length of Pm-MT DNA sequence，basis of the cDNA sequence. The full length of Pm-MT DNA sequence was 2 744 bp，made up of 2 introns and 3 exons. The promoter region was 806 bp，the length of introns were 1 194 bp and 242 bp respectively，the exons’ were 22 bp，78 bp and 77 bp each. And that predicted in the promoter region of glucocorticoid receptor element and estrogen response element with the ovarian development of two closely related transcription factors.

Key words： Penaeus monodon； metallothionein； gene DNA sequence clone； bioinformatic analysis

金屬硫蛋白（Metallothioneins，MTs）是一类富含半胱氨酸的胞内小分子蛋白，在动物、植物和微生物的细胞内广泛分布[1-3]。大量研究已证明，MTs具有调解氧自由基和氮氧化物并抑制细胞凋亡、重金属解毒、降低紫外线/离子辐射以及参与应激反应等多种生物学功能[4-12]。此外，MTs在生殖方面的功能也有不少报道。刘代成等[13]研究发现，血清孕酮和肝MTs之间呈正相关。Ioachim等[14]发现，MT基因在正常子宫内膜中的表达水平与雌、孕激素受体（ER、PR）呈负相关。Espey等[15]研究表明，绒毛膜促性腺激素（HCG）能促进小鼠卵巢中MT mRNA的表达显著增加。以上结果均表明，该基因参与了动物的生殖和繁育过程。

已有研究表明，斑节对虾MT的mRNA在其6个不同发育期的卵巢中表达量均很高，其中在Ⅱ期卵巢中的表达量最高[16]。因此，MT基因可能在斑节对虾卵巢发育过程中发挥了重要的调节作用。为了更深入研究这一功能，本研究克隆分析MT全基因DNA序列，为该基因在斑节对虾卵巢发育中分子调控机理提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

斑节对虾来源于海南省三亚市附近对虾养殖池塘，其体重20～30 g，用于DNA克隆分析。试验用虾在水温（25±1） ℃、盐度为3%的循环水池中暂养3 d后使用。

1.2 化学试剂

BspQⅠ、NotⅠ购自NEB公司；T4连接酶、Ex Taq购自TaKaRa公司；DNA分子量标准λDNA/Hind Ⅲ购自东盛公司；PCR 产物清洁试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自AxyGen公司；基因组DNA纯化试剂盒E.Z.N.A.？誖 MicroElute？誖 DNA Clean-Up Kit（D6296-00）购自OMEGA公司；海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒（DP324-02）、二抗（羊抗鼠IgG-HRP）和增强型HRP-DAB底物显色试剂盒购自天根生化科技有限公司。

1.3 斑节对虾金属硫蛋白全基因DNA的克隆

1.3.1 基因组DNA提取和纯化 按照海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN）使用说明提取合斑节对虾基因组DNA。按照MicroElute？誖DNA Clean-Up Kit（OMEGA）使用说明纯化基因组DNA。

1.3.2 Pm-MT基因内含子扩增 根据已知的Pm-MT基因cDNA全序列（GenBank 登录号ADQ28316.1），分别在5"UTR和3"UTR区域设计上下游引物SMT（31）和AMT（337）（表1），以斑节对虾基因组DNA为模板进行PCR扩增。

PCR扩增反应体系：10×Ex Taq Buffer （Mg2+ Plus） 2.5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L） 1.5 μL，AMT（337）（10 μmol/L）1 μL，SMT（31）（10 μmol/L）1 μL，Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL，DNA 1 μL，dH2O 17.25 μL，体系为25 μL。一扩PCR反应程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 35 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 50 s，35 个循环；72 ℃ 8 min；最后4 ℃保温。

1.3.3 Pm-MT基因启动子扩增 按照Genome Walking Kit（TaKaRa）的使用说明采用染色体步移的方法扩增Pm-MT基因5′上翼序列。根据已知的Pm-MT DNA序列设计3个特异性引物，分别为AMT（623）、AMT（341）和AMT（84）（表1）。

基因组DNA经纯化后，取适量作为模板，以AP Primer（4种AP1 Primer～AP4 Primer）作为上游引物，AMT（623）、AMT（341）和AMT（84）为下游引物，进行PCR反应。

PCR反应体系：10×LA PCR Buffer Ⅱ（Mg2+ Plus） 5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L） 8 μL，引物各1 μL，TaKaRa LA Taq（5 U/μL）0.5 μL，DNA 2 μL，dH2O 32.5 μL，总体系50 μL。PCR反应条件：94 ℃ 1 min；98 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，5個循环；94 ℃ 30 s；25 ℃ 3 min；72 ℃ 2 min；根据不同引物使用不同退火温度和时间。

1.3.4 序列分析 利用启动子分析软件BDGP（Berkeley Drosophila Genome Project）（http：///pub/programs/alibaba2/index.html）进行分析。

2 结果与分析

2.1 斑节对虾基因组DNA的提取

使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN）提取斑节对虾基因组DNA后，取5 μL用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测提取效果。如图1所示，DNA片段接近20 kb，主带清晰，可以满足后续试验要求。

2.2 Pm-MT内含子扩增结果

以5′UTR和3′UTR区域的上下游引物SMT（31）和AMT（337）进行PCR扩增，结果如图2所示。由图2可知，所得Pm-MT内含子条带在2 000 bp左右。

2.3 染色体步移结果

由图3可知，染色体步移PCR中，以AMT（623）、AP1-AP4为引物，扩增结果AP1-AP4对应均有明显条带；以AMT（341）为引物，扩增后AP1、AP2和AP3对应均有明显条带，而AP4的条带很弱；最后以AMT（84）为引物，只有AP2和AP3对应有明显条带，最大的清晰条带在1 000 bp左右。

2.4 Pm-MT基因DNA序列及启动子序列分析

选取染色体步移以AMT（84）进行PCR的明显条带，经切胶回收、克隆测序后进行序列分析。在测序结果中可找到特异性引物AMT（84），将此段序列与Pm-MT基因cDNA上游序列进行比对，确定两条序列对应部分一致。将克隆测序得到Pm-MT基因启动子序列806 bp、内含子扩增测序所得序列1 730 bp和Pm-MT cDNA序列502 bp拼接后获得基因组DNA全长（图4），该基因序列DNA全长为2 744 bp，由2个内含子和3个外显子组成，其中启动子区域为806 bp，2个内含子长度分别为1 194、242 bp， 3个外显子长度分别为22、78、77 bp。Pm-MT基因的外显子和内含子接头区符合手提拼接点和供体拼接点的Chambon法则（GT-AG法则）。

利用启动子分析软件BDGP（Berkeley Drosophila Genome Project）可预测到2个启动子序列分别位于-130～-81 bp处（TGCATAAATATATAAAAGATTAGTT

TCAGTTCAATCGTTAAAAGCTTAAC）和-38～12 bp处（CTTACGTCAATATAAACATTGTACACGTGGTGT

CCGACACAGAAGCTCAA）。

利用启动子结合位点分析软件TFSEARCH和Alibab2.1预测，可得到Pm-MT启动子区域包含2个TATA盒，分别位于转录起始位点上游-301～-295 bp处和-122～-114 bp处，无GC盒和CAAT盒。该基因启动子区还包含组成型表达转录因子Sp1、基因上游激活因子USF、增强子AP1和Oct-1、转录激活因子ATF、聚合酶相关蛋白RAP1、转录因子调控元件CRE-BP1、糖皮质激素应答元件GRE、热休克应答元件转录因子HSF、血清应答元件转录因子SRF、雌激素应答元件ERE，以及C/EBPalp、E4、C/EBPbeta、Antp、Ftz、YY1等潜在转录因子结合位点。

3 讨论

为进一步探讨Pm-MT与卵巢发育调控的关系，利用染色体步移技术和普通PCR技术相结合的方法，获得了Pm-MT基因的DNA全长序列，含3个外显子、2个内含子，与其他动物的MT基因基本一致[17]。不过，斑节对虾MT基因第一个内含子为1 194 bp，比一般动物的要长[17]。此外，斑节对虾MT基因内含子的两侧都具有RNA正确剪接所必须的识别位点（GT/AG），这与其他基因的内含子识别序列完全一致。

Pm-MT基因与斑节对虾的CHH基因[18，19]及中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因[20]DNA组成结构相类似，均含有与其他真核基因相似的启动子元件特征，包括TATA盒，cAMP效应元件结合蛋白CREB、Pit-1和AP-1等3个反应原件结合蛋白的结合位点。糖皮质激素应答元件GRE是MT基因内对甾体激素产生应答的元件，斑节对虾MT基因也含有。GRE通过与糖皮质激素受体结合体（glucocorticoid receptor，GR）结合，由此介导甾体激素对MT的诱导[21]。李文佼[22]利用克隆78 bp的人绒毛膜滋养细胞11β-羟基类固醇脱氢酶1型（11β-HSD1）基因启动子构建于含荧光素酶报告基因的质粒中，转染WISH细胞株，研究糖皮质激素启动子活性的机制。结果表明，皮质醇对WISH细胞11β-HSD1表达的调节作用是通过其基因启动子区实现的；皮质醇对11β-HSD1基因启动子活性的促进作用可能是通过翻译起始点上游78 bp的序列实现的，而且与糖皮质激素受体有关。万顺伦[23]利用大鼠海马11β-HSD1启动子区，构建以CAT酶为报告基因的pBLCAT6质粒并转染PC12细胞株，研究结果表明妊娠期糖皮质激素对海马神经元11β-HSD1表达的上调作用是通过MR和GR（以GR为主）和11β-HSD1启动子区实现的。据此可推论，Pm-MT的表达受体内甾体激素调控，并可能参与斑节对虾卵巢发育及生殖活动。根据软件Alibab2.1预测，Pm-MT基因启动子区域还含有雌激素應答元件ERE（estrogen responsive element）。Govind等[24]研究得到，雌激素与核受体ER结合，ER即形成二聚体，并与靶基因启动子序列内的增强子序列——雌激素应答元件ERE结合而诱导靶基因表达。雌激素是甾体激素，且预测中Pm-MT启动子区域的糖皮质激素应答元件和雌激素应答元件序列重合，提高了Pm-MT的表达受体内甾体激素调控此推测的可信度。而进一步确认Pm-MT表达与甾体激素调控的关系，需进行功能性研究。

胰高血糖素、血管紧张素、糖皮质激素均可诱导鼠、兔和家猫肝肾等器官金属硫蛋白的合成[13]。本研究根据Pm-MT基因在启动子区域的分析，推测Pm-MT在斑节对虾中的表达与CHH家族激素、甾体激素的调控相关。本推测与刘代成等[13]研究结论相似，为今后进一步研究该基因在斑节对虾卵巢发育中的作用提供了基础数据。

参考文献：

[1] INAGAWA M，ONOZAWA T，OKUMURA K，et a1.Characterization of metallot hionein cDNAs induced by cadmiun the nematode Caenorhabditis elegans[J].Biochem J，1990，268：237-240.

[2] FERRAZ P， FIDALGO F， ALMEIDA A， et al. Phytostabilization of nickel by the zinc and cadmium hyperaccumulator Solanum nigrum L. are metallothioneins involved[J].Plant Physiology and Biochemistry，2012，57：254-260.

[3] PALACIOS O，ATRIAN S，CAPDEVILA M.Zn-and Cuthioneins：A functional classification for metallothioneins[J].Journal of Biological Inorganic Chemistry，2011，16（17）：991-1009.

[4] 邢树礼，王洪光，赵 帅.金属硫蛋白的功能及应用前景[J].生物技术通报，2008（2）：45-47.

[5] COYLE P，PHILCOX J C，CAREY L C，et al. Metallothionein：The multipurpose protein[J].Cellular and Molecular Life Sciences，2002，59（4）：627-647.

[6] HAQ F，MAHONEY M，KOROPATNICK J.Signaling events for metallothionein induction[J].Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis，2003，533（1）：211-266.

[7] MIRANDA VIANA A C，RIBEIRO D C，FLOR？魭NCIO T N G，et al. Immunohistochemical expression of metallothionein in pleomorphic adenoma of minorsalivary glands：A role in the control of apoptosis[J].Acta Histochemica，2013，115（6）：564-568.

[8] BABULA P，MASARIK M，ADAM V，et al. Mammalian metallothioneins：Properties and functions[J].Metallomics，2012，4（8）：739-750.

[9] KRIZKOVA S，RYVOLOVA M，HRABETA J，et al. Metallothioneins and zinc in cancer diagnosis and therapy[J].Drug Metabolism Reviews，2012，44（4）：287-301.

[10] KUMAR S D，VIJAYA M，SAMY R P，et al. Zinc supplementation prevents cardiomyocyte apoptosis and congenital heart defects in embryos of diabetic mice[J].Free Radical Biology and Medicine，2012，53（8）：1595-1606.

[11] HANADA K，SAWAMURA D，TAMAI K，et al. Novel function of metallothionein in photoprotection：Metallothioneinnull mouse exhibits reduced tolerance against ultraviolet B injury in the skin[J].Journal of Investigative Dermatology，1998，111（4）：582-585.

[12] REEVE V E，NISHIMURA N，BOSNIC M，et al. Lack of metallothionein-Ⅰ and -Ⅱ exacerbates the immunosuppressive effect of ultraviolet B radiation and cis-urocanic acid in mice[J].Immunology，2000，100（3）：399-404.

[13] 劉代成，原永洁.孕酮对家猫金属硫蛋白的诱导[J].动物学报，1998，44（3）：375-376.

[14] IOACHIM E E，KSTSIOU E，CARASSAVOGLOU C，et a1. Immunohistochemieal loealization of metallothionein in endometrial lesions[J].Journal of Pathophysiology，2000，191：269-273.

[15] ESPEY L L，UJIOKA T，OKAMMN H，et a1. Metallothionein-Imessenger RNA transcription in steroidsecreting cells of the rat ovary during the periovulatory period[J].Biology of Reproduction，2003，68：1895-1902.

[16] 郑丽明，周发林，杨其彬，等.斑节对虾金属硫蛋白基因cDNA 克隆与表达分析[J].水生生物学报，2011，35（6）：913-919.

[17] 张 艳，杨传平.金属硫蛋白的研究进展[J].分子植物育种， 2006，4（3）：73-78.

[18] UDOMKIT A，TREERATTRAKOOL S，PANYIM S. Crustacean hyperglycemic hormone of Penaeus monodon：Cloning，production of active recombinant hormones and their expression in various shrimp tissues[J].Exp Mar Biol Ecol，2003，98：79-91.

[19] WIWEGWEAW A，UDOMKIT A，PANYIM S. Molecular structure and organization of crustacean hyperglycemic hormone genes of Penaeus monodon[J].Biochem Mol Biol，2004，37（2）：177-184.

[20] 宋 霞，周开亚，马长艳，等.中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1（Ers-MIH 1）基因组DNA的分子克隆和序列分析[J].动物学报，2004，50（1）：83-90.

[21] 刘秀英，王翔朴.真核生物中金属硫蛋白基因的转录调控[J].国外医学卫生学分册，1999，26（5）：301-307.

[22] 李文佼.糖皮质激素和促炎性细胞因子对人绒毛膜滋养细胞11β-羟基类固醇脱氢酶1型的调节及其机制研究[D].上海：复旦大学，2006.

[23] 万顺伦.妊娠期糖皮质激素对大鼠海马11β-羟基类固醇脱氢酶1型印迹作用的研究[D].上海：第二军医大学，2002.

[24] GOVIND A P，THAMPAN R V. Proteins interaction with the mammalian estrogen receptor：Proposal for an integrated model for estrogen receptor mediated regulation of transcription[J].J Cell Biochem，2001，80（4）：571-579.