猪细小病毒LAMP检测方法的建立

摘 要：猪细小病毒（Porcine Parvoviru，PPV）属于细小病毒科细小病毒属，通常感染初产母猪后会发生流产、不孕、产死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等病状。该病广泛存在于世界各地并在大多数猪场流行，中国PPV的感染也很广泛。因此本研究针对VP2基因作为靶序列设计引物，旨在建立一种可快速、灵敏、特异地检测PPV 的LAMP 检测方法。

关键字：猪细小病毒；环介导恒温扩增技术（LAMP）

Establishment of Loop-mediated Isothermal Amplifi

-cation for Detection of Porcine Parvoviru

Chen Xingyao1， Zhang Ziqun2， Wang Xiaolong1*

（ 1.Center of Conservation Medicine & Ecological Safety， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang， 150040；

2. Heilongjiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau， Harbin， Heilongjiang， 150000）

Abstract： Porcine Parvoviru（PPV） belongs to the genus of parvovirus and the family of parvovirus. It can infect primiparous sow and usually result to abortion， infertility， stillbirth， malformation， mummification and weaking piglet and so on. This disease is popular in most pig farms and is widespread around the world. Meanwhile Chinese PPV infection is also very extensive. We designed primers according to VP2 gene of PPV， and established a quick， sensitive and specific detection method of LAMP for PPV .

Keywords： Porcine Parvoviru； 1oop-mediated isothermal amplification（LAMP）

猪细小病毒（Porcine Parvoviru，PPV）属于细小病毒科细小病毒属。猪细小病毒粒子直径约18～26 nm，外观呈三角形或圆形，没有囊膜。成熟的病毒粒子基因组为单股负链DNA分子，大约5 000个碱基[1]。猪细小病毒主要引起猪繁殖障碍，通常会导致初产母猪发生流产、不孕、 产死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等病状发生[2， 3]。该病广泛存在于世界各地并在大多数猪场流行，严重地影响着养猪业的发展。猪细小病毒在中国已经普遍存在和传播。调查显示中国很多地区均有PPV的感染，比如黑龙江省[4]、河南省[5]、华中地区[6]、湖北省[7]、广西省[8]、广东省[9]等地区均有细小病毒感染的报道。 因此急需建立一种快速、便捷、灵敏且特异地PPV检测方法。

环介导恒温扩增技术（LAMP，1oop-mediated isothermal amplification） 是2000 年由日本的Notomi 等人发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法[10]。该技术具有特异性高、操作简便、反应快速、敏感性好、成本低廉等优点，在一些病原的检测中已被广泛应用[11， 12]。PPV有三种结构蛋白VP1、VP2和VP3，其中VP3是VP2水解后的产物，而VP2完全重叠于VP1中。本研究根据LAMP的工作原理，以VP2基因为目标基因，在优化相关反应条件的基础上，建立了适用于临床应用的猪细小病毒LAMP检测方法，以期为我国猪细小病毒的防控提供必要的技术方法。

1材料和方法

1.1病毒来源

猪细小病毒基因组、猪圆环病毒2型基因组、猪链球菌基因组、猪繁殖与呼吸综合征基因组、猪水泡病病毒基因组、伪狂犬病毒基因组、猪瘟病毒cDNA、猪流感cDNA、口蹄疫O型cDNA、猪蓝耳病cDNA由本单位分离并保存。

1.2主要试剂及仪器

Marker（DL2000，DL100）购自大连TaKaRa公司，dATP，dTTP，dCTP，dGTP均购买自大连宝生物公司。Bst DNA聚合酶，琼脂糖，甜菜碱，镁离子购自购自NEB公司；其他常规试剂均为国产分析纯。电子天平购自瑞士precisa公司；旋涡混合器购自北京金北德工贸有限公司；高速离心机和高速冷冻离心机均购自德国Kandro公司；PCR仪为美国Thermal Cycler公司的MJ—PTC200型；制冰机购自日本SANYO公司；微波炉购自海尔集团；DYY-6C型琼脂糖水平电泳仪购自北京市六一仪器厂；紫外凝胶成像系统购自香港Gene公司；湿热灭菌器购自日本SANYO公司；电热恒温鼓风干燥箱购自上海齐欣科学仪器有限公司；冰箱购自三星公司。

1.3引物设计及制备

应用网上lamp引物设计软件（PrimerExplorerV3）对VP2基因设计引物（图 1）。从获得的数百对引物中选择评分较高的引物，将设计好的序列发送至南京金斯瑞生物工程有限公司进行5"端修饰合成。

1.4 猪细小病毒LAMP检测方法的建立

猪细小病毒阳性样本测序后测定浓度，分装备用。

配制LAMP（2×）的反应缓冲液： 1M Tris-HCl （pH8.8） 贮存液 40 mL，KCl 1.49 g ，MgSO4 1.93 g，（NH4）2SO4 2.64 g，Tween-20 2 mL，Betaine 187.4 g，将上述试剂混合后加入ddH2O定容至900 mL，混匀后取900 μL。再加入100 μL的 25 mM dNTP混合液（dATP 25 μL、dCTP 25 μL、dGTP 25 μL、dTTP 25 μL）。

配制LAMP引物混合物（100 uM Primer stock）包括：FIP 20 μL，BIP 20 μL，F3 2.5 μL和B3 2.5 μL。

25 μL Lamp的反应体系：Bst DNA 聚合酶1 μL，猪细小病毒DNA 2 μL，ddH2O 8.6 μL，2倍的反应缓冲液12.5 μL，引物混合物0.9 μL。

1.5 LAMP反应条件优化

反应温度优化：根据反应体系优化策略，设置4组实验，分别为60℃，62℃，64℃及66℃，按1.4反应体系进行实验，反应时间为1 h，结束后各取2 μL样品在2%琼脂糖凝胶中进行分析。

反应时间优化：分别设置3个实验组，时间分别为30 min，45 min和60 min，按1.4反应体系进行实验，反应在62℃下进行，结束后各取2 μL样品在2%琼脂糖凝胶中分析。

1.6 LAMP灵敏度检测实验

将前述提取的猪细小病毒DNA进行浓度测定，依次倍比稀释成107～10-2个拷贝，按照1.4反应条件检测猪细小病毒LAMP引物的灵敏性。

1.7 LAMP特异性检测实验

以猪圆环病毒2型，猪链球菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪水泡病病毒、伪狂犬病病毒，猪瘟病毒、猪流感病毒、O型口蹄疫病毒、猪蓝耳病病毒和水作为供试样品，制备DNA或cDNA作为模板，按照建立的方法进行LAMP扩增，检测猪细小病毒LAMP的特异性。

1.8染料可视化试验

为进一步优化LAMP的反应条件，在LAMP反应结束后，加入2 μLSYBR Green Ⅰ荧光染料观察阴性和阳性反应颜色的变化情况。

2 实验结果与分析

2.1 LAMP反应条件优化

2.1.1温度优化

猪细小病毒LAMP引物温度优化实验中，扩增60 min后核酸电泳检测结果如图2所示，其中60℃，62℃，64℃和66℃均有扩增条带产生，阴性对

照无条带产生，因此LAMP引物扩增温度可选择60℃，62℃，64℃和66℃中任一温度。

2.1.2时间优化

猪细小病毒LAMP引物扩增在60℃下扩增不同时间的后核酸电泳检测结果（图3）。其中扩增45 min、60 min后均有扩增条带产生，30 min无条带产生，因此可选择LAMP反应的扩增时间为45 min。

2.2 LAMP灵敏度检测实验

猪细小病毒LAMP引物扩增不同浓度梯度基因后核酸电泳检测结果，扩增条件为60℃，扩增时间为45 min。如图4所示：107～101个拷贝的模板均有特异性产物产生，其余无条带产生，图4可看出本研究所设计的LAMP引物在60℃下，扩增45 min之后最少可检出10个拷贝的模板。

2.3 LAMP特异性检测实验

以猪细小病毒基因组为模板，使用LAMP引物在60℃下扩增45 min后核酸电泳检测结果。由图5可见，猪细小病毒LAMP引物特异性扩增出了猪细小病毒基因片段，而与其他病原并无交叉反应。

2.4染料可视化试验

向LAMP引物扩增不同浓度梯度基因的反应产物管内加2 μL SYBR GreenⅠ荧光染料，肉眼观察，阳性反应管颜色立刻变为黄绿色，且模板浓度不同颜色有深浅变化（图6）。由此可见，LAMP 反应结果容易判定，临床推广。

3结论

猪细小病毒基因组有两个主要的开放阅读框架，其中3′端编码结构蛋白（VP）。基因组共编码3种结构蛋白即VP1、VP2、VP3[13]。VP2蛋白完全重叠于VPI中，占总衣壳蛋白的60%以上是构成病毒粒子的主要蛋白。在猪细小病毒 VP2蛋白的近N端有连续的9个甘氨酸，这种GGG样的甘氨酸富集区折叠成A-螺旋结构，可能是产生VP3蛋白的切割位点[14]。猪细小病毒VP2基因在759～917位点有连续158个碱基是PPV所特有的，而且强毒株和弱毒株此段基因序列完全相同[1， 15]。所以本研究选取针对其结构蛋白VP2基因的保守序列，设计合成特异性引物。

LAMP是一种简便、快速、准确的基因扩增技术，只需在恒温条件下就能完成扩增反应，不需要特殊仪器设备，并且扩增结果可通过反应体系的浊度或加入染料来直观判断，在病原检测方面呈现出良好的应用前景[10， 16]。LAMP技术可以保证扩增的高特异性和高效率，其依赖于能够识别靶DNA 上6个特定区域的4条引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下扩增核酸，能从仅相差一个核苷酸的基因标本中找出相应靶序列进行扩增，根据扩增与否即可判断目的基因是否存在。

综合文中的试验结果，LAMP 检测技术为猪细小病毒基因的诊断提供了一种快速、便捷且特异性强、敏感性高的检测方法，可用于猪细小病毒临床检测，并具有非常良好的应用前景。（编辑：何芳）

参考文献：

[1]Molitor T， Joo H， Collett M. Porcine parvovirus： virus purificationand structural and antigenic properties of virion polypeptides[J]. Journal

of virology， 1983；45：842-54.

[2]Joo H， Donaldson-Wood C， Johnson R. Observations on the pathogenesis of porcine parvovirus infection[J]. Archives of virology， 1976；51：123-9.

[3] Mengeling W， Brown T， Paul P， et al. Efficacy of an inactivated virus vaccine for prevention of porcine parvovirus-induced reproductive failure[J]. American journal of veterinary research， 1979；40：204-7.

[4] 李英霞， 李长宏， 朱琪， 等. 黑龙江省猪细小病毒感染的流行病学调查[J]. 中国兽医杂志， 2001：22.

[5] 王川庆，范庆高，王相根，等. 猪细小病毒病的研究Ⅰ.河南省部分猪场母猪繁殖障碍的流行病学调查[J]. 中国畜禽传染病， 1995：45-7.

[6]何启盖， 陈焕春， 吴斌， 等. 规模化猪场猪瘟、细小病毒、口蹄疫抗体水平监测和免疫效果分析[J]. 中国预防兽医学报， 2000：6-10.

[7] 杨待建， 金升藻， 荣俊， 等. 湖北省猪细小病毒病流行的调查[J]. 中国预防兽医学报， 1999：67-70.

[8] 蒋玉雯. 广西猪细小病毒感染抽检简报[J]. 广西农业科学， 1987：41.

[9] 卢洪芬，任裕其，尹锦霞，等. 广东省猪细小病毒病血清学调查[J]. 中国兽医杂志， 1995：8-9.

[10] Notomi T， Okayama H， Masubuchi H， et al.. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic acids research， 2000；28：e63-e.

[11] Yang Z， Wei X， Wang Y， et al. Primary Study on Rapid Detection of European brown hare syndrome virus by RT-LAMP. Biomedical Engineering and Biotechnology （iCBEB）， 2012 International Conference on： IEEE； 2012. p. 441-5.

[12] FANG X LJ， CHEN Q. One New Method of Nucleic Acid Amplification-Loop-mediated Isothermal Amplification of DNA[J]. Virol Sin， 2008；23：167-72.

[13] Ranz AI， Manclús JJ， Díaz-Aroca E， et al. Porcine parvovirus： DNA sequence and genome organization[J]. Journal of general virology， 1989；70：2541-53.

[14]Kamstrup S， Langeveld J， B？tner A， et al. Mapping the antigenic structure of porcine parvovirus at the level of peptides[J]. Virus research， 1998；53：163-73.

[15]Molitor TW， Joo H， Collett M. Identification and characterization of a porcine parvovirus nonstructural polypeptide[J]. Journal of virology， 1985；55：554-9.

[16] 焦文强， 殷相平， 柳纪省. 环介导等温扩增技术原理及其在检测诊断病原微生物中的应用[J]. 生物技术通报， 2009；9：54-7.