雷公藤内酯醇对卵巢癌SKOV—3细胞株恶性生物学行为影响的实验研究

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[摘要] 目的 研究雷公藤内酯醇（TP）对卵巢癌SKOV-3细胞株恶性生物学行为的影响。 方法 培养卵巢癌SKOV-3细胞株，用0、10、20、40、80 nmol/L的TP处理，0 nmol/L TP处理的为正常对照（NC）组，10、20、40、80 nmol/L TP处理的为10 nmol/L TP组、20 nmol/L TP组、40 nmol/L TP组、80 nmol/L TP组，测定细胞活力及细胞Bcl-2、Bax、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1的mRNA含量。 结果 TP处理能以剂量依赖性和时间依赖性的方式降低卵巢癌细胞活力，同组不同时间点及同时间点多组间的细胞活力比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。10、20、40、80 nmol/L TP组细胞Bcl-2 mRNA含量（0.83±0.11、0.68±0.07、0.54±0.08、0.33±0.04）均低于NC组（1.00±0.15），Bax mRNA含量（1.32±0.15、1.66±0.21、2.19±0.35、3.22±0.63）均高于NC组（1.00±0.13），Beclin-1 mRNA含量（1.44±0.18、1.76±0.24、2.51±0.32、3.10±0.47）均高于NC组（1.00±0.18），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ（1.33±0.19、1.81±0.22、2.49±0.31、3.41±0.51）均高于NC组（1.00±0.17），差异有统计学意义（P < 0.05）。不同剂量TP组Bcl-2、Bax、Beclin-1 mRNA含量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 TP能够通过调节Bcl-2/Bax表达、细胞自噬的途径来抑制卵巢癌SKOV-3细胞株的增殖。

[关键词] 卵巢癌；雷公藤内酯醇；增殖；自噬

[中图分类号] R737.31 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）05（a）-0024-04

[Abstract] Objective To study the effect of triptolide （TP） on malignant biological behavior of ovarian cancer cell line SKOV-3. Methods Ovarian cancer SKOV-3 cells were cultured， treated with 0， 10， 20， 40， 80 nmol/L TP and 0 nmol/L TP treatment was NC group， 10， 20， 40， 80 nmol/L TP treatmet was 10 nmol/L TP group， 20 nmol/L TP group， 40 nmol/L TP group， 80 nmol/L TP group respectively. Cell viability and mRNA contents of Bcl-2， Bax， LC3-Ⅰ， LC3-Ⅱ， Beclin-1 were determined. Results TP decreased cell viability of ovarian cancer cell on dose dependent and time dependent manner， there were significant differences on cell viability in different time points the same group and the same time point between groups （P < 0.05）. Bcl-2 mRNA contents （0.83±0.11， 0.68±0.07， 0.54±0.08， 0.33±0.04） of 10 nmol/L TP group， 20 nmol/L TP group， 40 nmol/L TP group， 80 nmol/L TP group were lower than that of NC group （1.00±0.15）； Bax mRNA contents （1.32±0.15， 1.66±0.21， 2.19±0.35， 3.22±0.63） of 10 nmol/L TP group， 20 nmol/L TP group， 40 nmol/L TP group， 80 nmol/L TP group were higher than that of NC group （1.00±0.13）； Beclin-1 mRNA contents （1.44±0.18， 1.76±0.24， 2.51±0.32， 3.10±0.47） of 10 nmol/L TP group， 20 nmol/L TP group， 40 nmol/L TP group， 80 nmol/L TP group were higher than that of NC group （1.00±0.18）； LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ （1.33±0.19， 1.81±0.22， 2.49±0.31， 3.41±0.51） of 10 nmol/L TP group， 20 nmol/L TP group， 40 nmol/L TP group， 80 nmol/L TP group were higher than that of NC group （1.00±0.17）， with statistical differences （P < 0.05）. Bcl-2， Bax， Beclin-1 mRNA contents and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ in different doses of TP group were compared， with statistical differences （P < 0.05）. Conclusion TP can inhibit the proliferation of ovarian cancer cell line SKOV-3 through regulating the expression of Bcl-2/Bax and cell autophagy.

[Key words] Ovarian cancer； Triptolide； Proliferation； Autophagy

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，早期缺乏典型的临床症状，确诊时多数已发展至中晚期，预后情况较差、5年存活率不足30%。卵巢癌的死亡率位居女性生殖系统恶性肿瘤的前列，是威胁女性生命健康的重要疾病。化疗是临床上治疗晚期卵巢癌的常用方法，但是受到化疗药物不良反应、耐药性等因素制约，整体的化疗效果并不理想[1-2]。近年来，临床学者致力于探寻更加低毒性、高杀伤性的药物来治疗卵巢癌。雷公藤内酯醇（triptolide，TP）是从中药材雷公藤中分离得到的二萜内酯类化合物，对子宫内膜癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤的生长均有抑制作用[3-4]。但是，关于单独应用TP是否能影响卵巢癌细胞的恶性生物学行为尚未见报道，本研究主要分析TP对卵巢癌SKOV-3细胞株恶性生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

卵巢癌SKOV-3细胞株购于中科院细胞库，RPMI1640培养基、牛血清均购于Gibco公司，TP购于Sigma公司，MTS细胞活力检测试剂盒购于Promega公司，PCR试剂盒购于北京天根公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 SKOV-3细胞株复苏后用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养，待细胞生长至70%～80%的密度后用0.125%的胰酶进行消化，取消化后的细胞并重悬，接种在培养瓶或培养板中，培养瓶中的细胞用于继续传代，培养板中的细胞用于药物处理。

1.2.2 细胞处理 取培养板中的细胞，待细胞密度生长至80%左右，将含有血清的培养基更换为不含血清的培养基，24 h后在细胞孔内加入不同剂量的TP，培养孔内的药物终浓度分别为0、10、20、40、80 nmol/L。0 nmol/L TP处理的为正常对照（NC）组，不同剂量TP处理的为10 nmol/L TP组、20 nmol/L TP组、40 nmol/L TP组、80 nmol/L TP组。连续处理不同时间后进行后续检测。每批细胞重复5次。

1.2.3 细胞活力检测 检测细胞活力时，细胞接种在96孔细胞板中，药物处理12、24、48 h，分别在培养基中加入20 μL MTS检测试剂，继续孵育4 h后，在酶标仪上测定450 nm处的吸光度（OD）值。

1.2.4 mRNA含量测定 检测细胞中mRNA含量时，细胞接种在12孔细胞板中，药物处理24 h后，弃尽培养基，采用RNA提取试剂盒及反转录试剂盒进行实验操作，得到mRNA所对应的cDNA样本；取cDNA样本并进行稀释，然后采用PCR试剂盒配置反应体系，具体体系如下：cDNA样本1 μL、Mastermix反应液10 μL、20 μmol/L的上下游引物各0.4 μL、去离子水8.2 μL。按照下列程序进行PCR反应：95℃、15 s，特异性退火温度、20 s，72℃、25 s，重复40个循环，计算机自动生成扩增曲线及对应的起跳循环数（Ct值），通过2-ΔΔCt公式计算mRNA含量。扩增的基因包括Bcl-2、Bax、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin-1以及β-actin。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组计量资料比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组不同时间点细胞活力比较

TP处理24 h的半最大效应浓度（EC50）为36.8 nmol/L，处理48 h的EC50为13.5 nmol/L。同时间点多组间比较：处理后12、24、48 h，TP组细胞OD值均显著低于NC组，且TP剂量越大，细胞OD值越低；同组不同时间点比较：TP组细胞处理后12、24、48 h的OD值有差异，处理时间越长，细胞OD值越低。见表1。

2.2 各组细胞Bcl-2、Bax mRNA含量比较

处理后24 h，TP组细胞Bcl-2 mRNA含量显著低于NC组，Bax mRNA含量显著高于NC组，且TP剂量越大，细胞Bcl-2 mRNA含量越低、Bax mRNA含量越高。见表2。

2.3 各组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 mRNA含量比较

处理后24 h，TP组细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 mRNA含量均显著高于NC组；TP剂量越大，细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 mRNA含量越高。见表3。

3 讨论

化疗是目前临床上治疗晚期卵巢癌的主要方法，配合以放疗能够在一定程度上延长患者的生存时间，但是整体预后并不理想，5年生存率也较低[5-7]。癌细胞对化疗药物产生耐药性是造成卵巢癌化疗效果不佳的主要原因[8-9]，探寻更为有效的卵巢癌化疗药物一直是临床学者研究的热点。雷公藤是临床上用于抗炎、抗肿瘤、免疫调节等治疗的中药材，TP是从雷公藤中分离得到的二萜内酯类化合物，也是雷公藤的有效成分。已有离体研究证实，TP对子宫内膜癌、胰腺癌等恶性肿瘤细胞的增殖具有抑制效应，能够造成DNA断裂、染色质凝集以及凋亡小体形成[3-4]。

近年来，有国内学者报道了TP联用紫杉醇、顺铂等化疗药物对卵巢癌细胞的体外活性具有抑制作用[10-11]，但是关于TP单药处理对卵巢癌细胞的影响尚未见报道。本研究根据前期预实验结果选择10、20、40、80 nmol/L的TP来处理体外培养的卵巢癌细胞，通过测定细胞活力可知，TP能以剂量依赖性和时间依赖性的方式降低卵巢癌细胞的活力。由此初步证实，TP对卵巢癌细胞的增殖具有抑制效应，推测其具备用于卵巢癌治疗的潜在价值。

线粒体凋亡途径是调节细胞活力的重要机制，Bcl-2家族是介导线粒体凋亡途径的主要分子[12-13]。Bax是Bcl-2家族中的促凋亡分子，能与线粒体膜结合并形成渗透性膜转移孔复合物，调节线粒体膜转换孔的开放和关闭，诱导线粒体释放细胞色素C并通过下游Caspase家族来造成细胞凋亡[14-15]；Bcl-2是Bcl-2家族中的抗凋亡分子，能与Bax形成异源二聚体，拮抗Bax诱导线粒体细胞色素C释放的作用，从而抑制下游Caspase分子的活化及其所介导的细胞凋亡[16]。在使用TP处理后24 h检测，TP能减少Bcl-2的mRNA含量，增加Bax的mRNA含量，且药物剂量越大，细胞Bcl-2的mRNA含量越低、Bax的mRNA含量越高。这说明TP能通过Bcl-2/Bax所介导的线粒体凋亡途径来调节卵巢癌的活力。

自噬是近年来新发现的细胞凋亡机制，又称为Ⅱ型程序性死亡，指细胞通过溶酶体降解自身受损细胞器及异常大分子物质的过程[17-18]。在恶性肿瘤的发生和发展过程中，自噬过程显著受到抑制，无法清除体内异常增殖的肿瘤细胞，从而造成肿瘤发生和发展[19]。LC3是公认的自噬标志分子，在自噬处于低水平时，非活化状态的LC3-Ⅰ表达量高于活化状态的LC3-Ⅱ；自噬被激活时，LC3-Ⅱ的表达显著上调、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例增加[20-21]。同时，在自噬激活及自噬体形成的过程中，自噬相关基因ATG-6的同源基因Beclin-1高表达发挥了至关重要的作用[20，22-23]。TP处理后的细胞自噬水平测定结果显示，TP能够显著增加细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例、Beclin-1含量，且TP剂量越大，细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例、Beclin-1含量越高。这说明自噬是TP调节卵巢癌细胞活力的另一个途径。

综上所述，TP能够通过调节Bcl-2/Bax表达、细胞自噬的途径来抑制卵巢癌SKOV-3细胞株的增殖。

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（收稿日期：2016-01-16 本文编辑：李亚聪）