褐飞虱组蛋白H3与H2A基因启动子克隆与序列分析

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摘要：褐飞虱是对水稻危害最严重的害虫之一，目前缺少对褐飞虱内源高效启动子的研究。以褐飞虱的组蛋白H3与H2A基因为研究对象，通过已知的果蝇H3与H2A序列搜寻Genbank上褐飞虱表达序列标签（expressed sequence tags，简称EST）数据库，从而获得同源序列来设计嵌套引物。然后通过染色体步移的交错式热不对称PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，简称Tail-PCR）技术获得H3与H2A ATG前侧翼序列，分别为1 664、538 bp。PLACE软件在线分析TATA框、CAAT框、GATA框。为外源基因在褐飞虱细胞内高效表达以及褐飞虱转基因相关研究奠定基础。

关键词：褐飞虱；组蛋白H3；组蛋白H2A；启动子；Tail-PCR；基因工程

中图分类号： S435.112+.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）23-0030-03

在基因工程研究中常常需要目的基因高效表达，于是分离强启动子已成为目前基因工程的基础工作之一。高等动植物的基因调控主要是在转录水平上进行的，受各类顺式调控元件与反式调控元件协同调控。高等生物启动子主要分为3类，第1类为组成型表达启动子，这类启动子一般调控看家基因表达。组成型启动子在所有组织中都能启动基因的表达，具有持续性，不表现时空特异性；第2类为组织特异型启动子，一般调控基因在特定组织和器官中表达；第3类为诱导型启动子，一般受某种信号诱导开启基因表达，让基因在特定发育时期或特定组织器官、特定生长环境下表达[1]。其中组成型表达启动子应用比较广泛，主要应用于目的基因超量表达以及转基因研究中。看家基因别称持家基因（house-keeping genes），是指所有细胞中组成型表达的一类基因，其产物是维持细胞各种基本生命活动所必需的[2]。褐飞虱（Nilaparvata lugens Stl）是危害水稻最大的害虫之一，我国目前有1 300万～2 000万hm2 水稻受到褐飞虱危害[3]，对褐飞虱的研究成为农业病虫害防治重要课题之一。目前在褐飞虱分子生物学中缺少对其自身基因内源启动子的研究，相关研究也较少。以分离褐飞虱看家基因启动子序列为目的，用染色体步移技术得到组蛋白H2A与H3基因ATG前启动子序列，并对启动子序列进行结构与特征分析。本研究以分离组成型表达基因启动子为目的，为外源基因在褐飞虱细胞内高效表达以及褐飞虱转基因相关研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料与试剂

供试褐飞虱饲养在温室，温室的温度条件为22～28 ℃，保持合适的光照和湿度条件，以保证水稻和褐飞虱在良好环境下生长。Top 10感受态细胞为笔者所在实验室保存。Genome walking试剂盒、PMD18-T Simple Vector、DNA solution I均购自宝生物工程（大连）有限公司；PCR产物胶回收试剂盒购自美国Omega仪器仪表有限公司；其他试剂为国产或进口分析纯。

1.2褐飞虱DNA提取

褐飞虱基因组DNA提取皆为单头虫提取。所用方法为十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium ammonium bromide，简称CTAB）法参照文献[4-5]，并略有改动。将采集的单头褐飞虱放入装有400 μL质量分数为2% CTAB的 1.5 mL 离心管中，用匀浆小棒捣碎匀浆，将匀浆液放入 60 ℃ 水浴锅水浴裂解60 min，向裂解后的匀浆液中加入200 μL三氯甲烷/异戊醇（体积比为24 ∶1）抽提2次，加入2倍体积无水乙醇，-20 ℃条件下沉淀；最后将风干后的DNA溶于 50 μL TE中，置于-20 ℃条件下保存备用。

1.3扩增引物

目前褐飞虱H3、H2A序列还没有被公布，用果蝇的H3、H2A mRNA序列在NCBI的褐飞虱EST数据库中进行Blast比对，这样就获得与果蝇H3、H2A高度同源的EST片段，以EST片段序列为模板来设计引物（表1）。

1.4Tail-PCR扩增

3轮反应总体系50 μL，包括1 μL模板；2.5 mmol/L dNTPs 8 μL；10×LA PCR Buffer Ⅱ（Mg2+ plus）5 μL；LA Taq（5 U/μL）0.5 μL；随机引物与特异引物（100 pmol/μL）各 1 μL；加入dH2O至总体积50 μL。以H3第1次Tail-PCR为例，试剂盒的AP2、AP3、AP4引物分别首先与H3W1-1引物進行第1轮扩增，扩增产物为模板再加入各自对应AP简并引物和H3W1-2进行第2轮，同理以H3W1-2和AP引物进行第3轮扩增，第3轮扩增结束后电泳跑胶并选取扩增带型效果好的一组组合。PCR反应条件参照Genome Walking试剂盒说明书。

1.5PCR产物测序与序列分析

将扩增产物用DNA胶回收试剂盒回收后和PMD18-T载体按浓度比为3 ∶1混合，加入等体积DNA solution I，16 ℃连接5 h。将连接片段转化Top10感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的固体培养基平板，37 ℃条件下培养过夜，挑取白色菌落。以载体通用测序引物M13-47和RV-M进行菌落PCR扩增，1%琼脂糖电泳检测插入片段大小，将阳性克隆的菌液送出测序。序列先在Genbank Blastn上进行比对，确定是否为目的序列。通过PLACE在线启动子预测工具分析启动子功能元件。

2结果与分析

2.1Tail-PCR扩增结果

对于H3基因和H2A基因各自3条特异引物和试剂盒AP2、AP3、AP4简并引物组合，3轮热不对称PCR后，H3基因的AP3的组合能扩增到1条约900 bp的片段（图1-a），H2A基因的AP3组合能扩增到1条约800 bp的片段（图1-b）。将扩增到的片段T-A克隆测序后在Genbank上进行Blastn比对，证实为褐飞虱H3、H2A基因ATG前端序列。根据测序结果，又设计3条特异性引物继续对H3向前walking，交错式热不对称PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，简称 Tail-PCR）获得约1.1 kb片段（图1-c），测序后将其与前面测序结果拼接。根据测序结果，获得H3 ATG前端1 664 bp序列，获得H2A ATG前端538 bp序列。

2.2启动子序列分析

将得到H3与H2A ATG上游序列与Genbank上的褐飞虱

EST数据库进行比对发现，H3 5′非翻译区（untranslated region，简称UTR）有1条549 bp的内含子（图2），H2A起始密码子ATG后有一段143 bp的內含子序列（图3）。PLACE软件在线分析预测TATA框、GAAT框、CAAT框等启动子核心原件（图2、图3）。

3讨论

真核生物DNA是以染色质形式存在的，而染色质的基本组成单位为核小体，核小体则由核心组蛋白组成，其组成方式为以组蛋白H2A、H2B、H3和H4各2个分子形成八聚体，DNA则缠绕在此八聚体上形成核小体[6]。茅卫峰等克隆了虹蹲鱼H3的启动子序列并将H3启动子插入启动子缺失的增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，简称EGFP）表达载体pEGFP-1中，通过显微注射法注射重组载体，结果表明，H3启动子能启动报告基因EGFP在各组织中的高效表达[7]。DNA未知区域序列克隆一般采用染色体步移技术，染色体步移技术主要基于2种方法，1种是基于基因组文库为主要手段的染色体步移技术，另1种是基于PCR技术的染色体步移技术。基于PCR的染色体步移技术又主要以连接成环PCR、外源接头介导PCR和半随机引物PCR技术为主[8]。基于随机引物的PCR技术的热不对称交错PCR（Tail-PCR）是比较常用的获得侧翼序列的方法，由Liu等最早设计[9]，其原理是基于巢式PCR，利用3个嵌套的特异引物和1个较短的随机简并引物进行3次热不对称PCR扩增，逐渐扩增到特异性的目的基因产物。本研究首先通过果蝇的组蛋白H3基因和H2A基因序列在褐飞虱EST数据库中搜寻同源序列，以此获得褐飞虱H3、H2A基因的部分序列，然后设计嵌套特异引物，通过Tail-PCR技术获得H3、H2A基因ATG前端序列，分别为1 664、538 bp，并对获得的ATG前端侧翼序列运用PLACE软件在线分析其启动子元件。本研究为外源基因在褐飞虱细胞内高效表达以及褐飞虱转基因相关研究奠定基础。

参考文献：

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[3]冯冉冉，高晓，刘丕庆. 褐飞虱抗性基因及其在籼型杂交水稻育种上的应用[J]. 安徽农业科学，2015，43（15）：107-110.

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