耳聋及耳聋高危人群中的GJB2基因热点突变分析

[摘要] 目的 分析GJB2基因热点突变在耳聋及耳聋高危人群中的突变谱和突变频率。 方法 收集2014年11月～2017年3月江苏地区耳聋患者59例及耳聋高危人群49例，应用荧光PCR法对其进行GJB2基因的4个热点突变位点筛查，分析突变数据，通过直接测序法验证其全部检测结果。 结果 108例研究对象中，检测出GJB2基因突变共84例，检出率为77.78%。其中c.235del C、c.299-300delAT、c.176del16bp和c.512insAACG检出率分别为62.96%（68/108）、17.59%（19/108）、13.89%（15/108）和0.93%（1/108）。耳聋患者中GJB2 c.235del C纯合突变和GJB2双等位基因突变发生率分别为30.51%（18/59）和28.81%（17/59），耳聋高危人群中未发现纯合突变和双等位基因突变。进一步采用直接测序法验证全部检测结果，其结果与荧光PCR法一致。 结论 在本研究中c.235del C是最常见的热点突变，GJB2 c.235del C纯合突变是最为常见的分子致病因素，其次是GJB2双等位基因突变。

[关键词] GJB2基因；荧光PCR；突变分析

[中图分类号] R764.43 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）12（c）-0033-04

[Abstract] Objective To analyze the mutation frequency and spectrum of GJB2 gene hotspot mutations in the deafness patients and the high risk population. Methods There were 59 cases of deafness patients and 49 cases of high risk population in Jiangsu who were collected from November 2014 to March 2017. Four common mutations of GJB2 gene were detected by fluorescencence PCR technique. The mutation data were analyzed and summarized， and all results were further validated by Sanger sequencing. Results Allelic variants were observed in 84 of the 108 subjects with a positive rate of 77.78% （84/108）. The incidences of c.235del C， c.299-300delAT， c.176del16bp and c.512insAACG were 62.96% （68/108）， 17.59% （19/108）， 12.96% （14/108） and 0.93% （1/108） respectively. The carrying rates of homozygous genes in GJB2 c.235del C and biallelic mutations in GJB2 in the deafness patients were 30.51% （18/59） and 28.81% （17/59）. No homozygous genes and biallelic mutations were found in the high risk population. All results further validated by Sanger sequencing showed consistent with those by fluorescence PCR technique. Conclusion In this study， c.235delC mutation is the hotspot of GJB2 gene mutation. GJB2 c.235del C homozygous genes are the most common molecular risk factors followed by GJB2 biallelic mutations.

[Key words] GJB2 gene； Fluorescence PCR； Mutation analysis

先天性耳聾是人类最常见的出生缺陷之一，发病率为1‰～3‰。我国作为人口大国，听力言语残者多达2780万，占残疾人总数的33.58%，其中0～6岁听障儿童达13.7万，且每年新生聋儿2.3万[1]。50%以上的先天性耳聋可能与遗传因素相关[2]，已发现40多个与耳聋相关的基因，100多个基因位点[3]。其中缝隙连接蛋白beta2（gap junction protein beta2，GJB2）基因突变被认为是引起遗传性耳聋的常见原因之一[4-7]。本研究应用荧光PCR法检测江苏部分地区耳聋及耳聋高危人群的GJB2基因，分析其突变谱和突变频率，为耳聋及耳聋高危人群的遗传咨询和产前诊断提供理论基础，探讨采用荧光PCR法对耳聋高危人群检测的临床意义。

1 对象与方法

1.1 对象

收集2014年11月～2017年3月来自于江苏地区的研究对象108例，均为汉族，年龄1～49岁。其中耳聋患者59例，均为感音神经性耳聋，在医生指导下填写“耳聋基因筛查记录册”，获取相关信息，包括一般情况、发病年龄、个人史及家族史；耳聋高危人群49例，为上述耳聋患者二代以内近亲属或配偶，听力均正常。所有研究对象均签署知情同意书，项目研究通过江苏省计划生育科学技术研究所伦理医学委员会评审。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器与试剂 TIANamp Blood DNA Kit（天根生物技术公司），GJB2基因检测试剂盒（荧光PCR法）（济南英盛生物技术有限公司），ABI 9700 PCR扩增仪。

1.2.2 基因提取 采集受检者3～5 mL外周静脉血（空腹），血液放入EDTA抗凝剂的真空采血管，统一编号。应用TIANamp Blood DNA Kit分离全基因组DNA，按试剂盒说明书操作，分光光度法检测DNA浓度和纯度，DNA浓度在1～300 ng/μL范围内，纯度（A260/A280）在1.7～1.9为合格。

1.2.3 基因检测 采用GJB2基因检测试剂盒探针特异性PCR技术，按照GJB2基因的4个常见突变位点（235delC、299-300delAT、176del16bp、512insAACG）的突变序列来设计高度特异的双标记荧光TaqMan探针，通过在ABI 9700 PCR仪上进行PCR扩增，与模板DNA结合，收集荧光信号，累积曲线，实时读取定性结果，判读是否存在相关基因位点的突变。PCR反应条件见图1。阴阳性质控扩增判读见图2、3，可依据此位点的阴阳性质控扩增图判读样本该检测位点的结果。全部结果进一步采用直接测序法进行验证。

1.2.4 DNA测序 GJB2基因引物设计，PCR特异片段扩增体系、温度、时间等条件的设置参照文献[8]。PCR产物行2%琼脂凝胶电泳，选取PCR扩增产物纯化，在ABI3700自动测序仪上行直接测序（正反向测序），通过DNAstar软件的SeqMan分析测序结果。

2 结果

2.1 GJB2基因突变情况

108例研究对象中，共检测出GJB2基因突变84例，检出率为77.78%。其中单等位基因突变67例、双等位基因突变17例；纯合突变20例、杂合突变64例；四个常见的位点c.235del C、c.299-300delAT、c.176del16bp和c.512insAACG突变检出率分别为62.96%（68/108）、17.59%（19/108）、13.89%（15/108）和0.93%（1/108）。

2.2 不同研究对象中GJB2基因突变位点、突变方式及分布情况

耳聋患者中发现了20例GJB2纯合突变和17例双等位基因突变。其中c.235del C纯合突变18例，c.299-300delAT纯合突变1例，c.176del16bp纯合突变1例。GJB2 c.235del C纯合突变和GJB2双等位基因突变发生率分别为30.51%（18/59）和28.81%（17/59）。耳聋高危人群中发现了36例GJB2突变基因携带者，携带率为72%（36/49），未发现纯合突变和双等位基因突变，见表1。采用直接测序法检测全部研究对象的检测样本，结果与荧光PCR完全一致。

3 讨论

在我国听力残疾是最常见的出生缺陷之一，是目前提高人口素质、改善生活质量所面临的严峻公共卫生问题。随着对耳聋分子病因学的研究，遗传因素在耳聋的发病中得到越来越多的重视。遗传性耳聋患者的60%～70%为非综合征性耳聋（nonsyndromic hearing impairment，NSHI），又有80%的NSHI属于常染色体隐性遗传[9]。研究证实GJB2基因突变引起的NSHI耳聋较为常见[10-11]，GJB2基因编码区为678 bp，主要由两个外显子组成，编码区主要存在在外显子2上[12]，其基因编码产物为缝隙连接蛋白（Connexin-26，Cx-26），Cx-26分布于耳蜗的血管纹、基底细胞、螺旋缘凸、神经感觉上皮及耳蜗传导纤维等处，参与细胞间信号介导和离子传递，突变的GJB2基因可能导致Cx-26异常，进而影响细胞间隙的连接功能，引起内耳钾离子回收障碍而致耳聋[13-16]。

GJB2呈常染色体隐性遗传，临床相关症状为重度以上感音神經性耳聋，往往隔代遗传，男女均可罹患，发现后可通过植入人工耳蜗干预，避免因聋致哑。在本研究人群中，c.235delC发生频率最高，符合235delC为国内最常见的基因突变的结论[17-18]，GJB2 235delC纯合突变是最为常见的分子致病因素，与以往研究结果[19-20]一致。另本研究非聋高危人群中共发现了36例GJB2突变基因携带者，携带率高达72%（36/49），明显高于柳红杰[18]、韩明昱[21]等的报道，分析其原因可能是目标人群不同，本研究目标人群主要来源于聋人及其直系亲属、配偶，柳红杰[18]、韩明昱[21]等则为正常听力孕妇。

聋哑人因自身情况特殊，在现实社会常以“聋-聋”婚配形式存在，聋人夫妻具有相同基因突变位点的概率大大增加，后代耳聋风险也相应增加。因此依据遗传模式对聋人或突变基因携带者等高危人群进行检出率较高的GJB2基因的突变检测，进一步的进行相关婚育指导和后代遗传性耳聋风险的评估很有必要。据此，广泛开展耳聋基因筛查与耳聋产前诊断，实现遗传性耳聋的二级预防，在婚检或生育前进行耳聋基因筛查，可避免双方均为同一耳聋突变基因携带者的夫妇生育聋儿。此外，通过孕期母亲或新生儿的耳聋基因筛查，可及早地发现药物性耳聋敏感个体、迟发性遗传性耳聋个体，通过早期干预，可有效预防耳聋发生。

人类基因组的复杂性及耳聋基因的高度遗传异质性加大了耳聋基因检测的难度，给遗传性耳聋的诊断及预防带来了一定的困难。基因直接测序技术是目前应用最多的遗传性耳聋检测方法，也是迄今为止分子诊断学中基因突变检测的金标准，其具有技术平台标准化、结果直观、准确性极高等优点，可以对任意基因进行全序列分析，但因其费时、费力且成本较高，这种方法尚不具备应用于大规模人群筛查的条件。耳聋高发致病基因及突变热点存在种族和人群差异，国内开展的大规模耳聋分子流行病学研究表明，中国绝大部分遗传性耳聋只与少数几个基因有关，如GJB2、SLC26A4、12SrRNA及GJB3等[22-23]，为热点基因筛查方法应用于大规模人群筛查提供了理论依据。本研究采用荧光PCR法检测耳聋基因具有检测基因位点选择灵活、耗时短，高通量、低成本、操作简便快捷、结果判读简单等优点，能够满足对中国人群耳聋基因热点突变筛查的要求。

[参考文献]

[1] 第二次残疾人抽样调查办公室.全国第二次残疾人抽样调查主要数据手册[C].北京：华夏出版社，2007：2-38.

[2] Bitner-G1indzicz M. Hereditary deafness and phenotyping in humans [J]. Br Med Bull，2002，63（1）：73-94.

[3] Koy A，Freynhagen R，Mayatepek E，et al. Hereditary sensory and autonomic neuropathy with autonomic crises：A Turkish variant of familial dysautonomia [J]. J Child Neurol，2012，27（2）：191-196.

[4] Wei Q，Wang S，Yao J，et al. Genetic mutations of GJB2 and mitochondrial 12S rRNA in nonsyndromic hearing loss in Jiangsu province of China [J]. J Transl Med，2013，11（1）：163.

[5] Jiang H，Chen J，Shan XJ，et al. Prevalence and range of GJB2 and SLC26A4 mutations in patients with autosomal recessive nonsyndromic hearing loss [J]. Mol Med Report，2014，10（1）：379-386.

[6] Grillo AP，de Oliveira FM，de Carvalho GQ，et al. Single nucleotide polymorphisms of the GJB2 and GJB6 genes are associated with autosomal recessive nonsyndromic heating loss [J]. Biomed Res Int，2015，2015（7164）：318 727.

[7] 戴樸.遗传性耳聋的预防和阻断[J].中华医学杂志，2007， 87（40）：2811-2813.

[8] 李建瑞，刘涛，严江伟，等.散发性耳聋GJB2基因突变分析[J].山东大学耳鼻喉眼学报，2011，25（6）：33-36.

[9] 卢彦平，程静，韩冰，等.荧光定量PCR技术用于遗传性耳聋基因检测胎儿的21三体综合征筛查的可行性[J].中华妇产科杂志，2011，46（6）：427-430.

[10] 王国建，张冠斌，袁永一，等.十五项遗传性耳聋基因突变微阵列诊断芯片的临床应用研究[J].中华耳科学杂志，2014，12（1）：6-10.

[11] 高雪，辛凤，袁慧军，等.遗传性耳聋相关基因SLC26A4新突变致病性分析[J].中华耳科学杂志，2014，12（1）：26-29.

[12] Denoyelle F，Marlin S，Weil D，et al. Clinical features of the prevalent form of childhood deafness，DFNB 1，due to a connexin-26 gene defect：implications for genetic counseling [J]. Lancet，1999，353（9161）：1298-1303.

[13] Dai Z，Sun B，Huang S，et al. Correlation analysis of phenotype and genotype of GJB2 in patients with non-syndromic hearing loss in China [J]. Gene，2015，570（2）：272-276.

[14] Salman M，Bashir R，Imtiaz A，et al. Mutations of GJB2 encoding connexin 26 contribute to non-syndromic moderate and severe hearing loss in Pakistan [J]. Eur Arch Otorhinolaryngol，2015，272（81）：2071-2075.

[15] Tsukada K，Nishio S，Hattori M，et al. Ethnic-specific spectrum of GJB2 and SLC26A4 mutations their origin and a literature review [J]. Ann Otol Rhinol Laryngol，2015， 124（1）：61-76.

[16] Terrinoni A，Codispoti A，Serra V，et al. Connexin 26（GJB2） mutations as a cause of the KID syndrome with hearing loss [J]. Biochem Biophys Res Commun，2010， 395（1）：25-30.

[17] 郑文波，罗建红，郦云，等.中国人语前非综合征性耳聋患者GJB2基因的突变分析[J].中华儿科杂志，2000，38（10）：610-613.

[18] 柳红杰，刘日明，从江琳，等.育龄期夫妇非综合征性耳聋基因突变位点检测结果分析[J].中华生物医学工程杂志，2016，22（3）：194-199.

[19] 陈红胜，梅凌云，贺楚峰，等.湖南地区汉族非综合征型耳聋相关基因检测及热点突变分析[J].中国耳鼻咽喉颅底外科杂志，2013，19（6）：475-480.

[20] 刘亚兰，汪俊程，邓宇元，等.荧光PCR法在非综合征型遗传性耳聋基因诊断中的应用研究[J].中国耳鼻咽喉颅底外科杂志，2016，22（5）：345-352.

[21] 韩明昱，楚严，卢彦平，等.孕期女性常见耳聋基因筛查与耳聋出生缺陷干预[J].中华耳科学杂志，2011，9（3）：289-295.

[22] 王国建，戴朴，韩东一，等.基因芯片技术在非综合征性耳聋快速基因诊断中的应用研究[J].中华耳科学杂志，2008，6（1）：61-66.

[23] 石之驎，王沙燕，张阮章，等.非综合征型感音神经性聋患儿GJB2基因突变分析[J].中国医学创新，2016，13（21）：21-24.

（收稿日期：2017-10-23 本文编辑：任 念）