大鼠肝脏损伤早期NF—κB时序性表达的实验性研究

[摘要] 目的 研究大鼠肝脏损伤后细胞核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）在肝脏组织中的表达变化，探讨其表达变化与损伤时间的关系。 方法 采用自由落体撞击法建立大鼠肝脏损伤模型，应用免疫组织化学方法检测伤后不同时间NF-κB的表达水平，并应用图像分析系统进行分析。 结果 正常组织中有少量的NF-κB阳性表达。NF-κB在伤后0.5 h开始逐渐增高，8 h达高峰，12～24 h略有下降，但仍保持较高水平。统计分析结果提示：各实验组与对照组及与相邻上组比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 大鼠肝脏损伤后NF-κB表达持续增加，8 h达峰值，12～24 h持续高表达并出现下降趋势，其规律性表达可望用于肝脏早期损伤时间的推断。

[关键词] 法医学；肝脏；损伤时间；NF-κB

[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）05（b）-0014-03

肝脏是人体最大的实质性器官，因其具有体积大、质地脆、不易移动等特点，故较易受伤，且以闭合性损伤多见。闭合伤有时诊断不易，又常合并多脏器功能损伤，有报道称死亡率可高达10.5%～25.0%[1]。目前对于肝脏损伤的研究主要集中在免疫性与化学性肝损伤，而对机械性肝损伤的的研究相对较少。因此，本研究通过建立大鼠肝损伤模型，采用免疫组织化学方法动态观察大鼠肝脏损伤后不同时间NF-κB的表达变化规律，探讨其与损伤时间的相关性并评估其在法医学实践中的应用前景。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

SV-0002两步法免疫组化检测试剂盒；兔抗大鼠NF-κB p65多克隆抗体（BA0610）；聚合HRP标记抗兔IgG二抗，DAB显色试剂盒，均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 动物分组

健康成年雄性SD大鼠48只，体重（250±30）g，由山西医科大学实验动物中心提供。随机分为8组，分别为对照组、损伤后0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h组，每组6只。

1.3 动物模型的建立及取材

参照自由落体撞击法复制大鼠钝性肝脏撞击伤模型。大鼠称重后，10%水合氯醛以3 mL/kg的剂量腹腔注射麻醉。（1）对照组：于机械性处死后即刻取材；（2）损伤组：采用自由落体打击装置，以50 g砝码从150 cm高处垂直自由下落对大鼠上腹部剑突处撞击致伤，并于损伤后预定时间处死大鼠，提取肝脏组织，迅速放入4%多聚甲醛中固定16 h。

1.4 免疫组织化学染色

常规组织脱水、石蜡包埋，3 μm厚度连续切片。免疫组织化学方法采用Super Vision两步法，具体步骤同试剂盒说明。一抗为兔抗大鼠NF-κB p65多克隆抗体（1∶75），另以PBS代替一抗作为空白对照，定性观察的切片复染，定量检测的切片不复染。

1.5 图像分析与数据处理

采用MIAS-2000医学图像分析系统，显微镜400倍下在每张未复染的切片中随机选取5个视野，测定目标平均灰度Go、视场平均灰度Gv及面积密度AAa，并通过以下公式计算阳性单位（positive unit，PU）：PU=︳Go-Gv︳×100/[（1-AAa） Gmax]，其中Gmax为固定值255，表示检测仪的最大灰度。

1.6 统计学方法

运用SPSS 16.0软件进行数据处理，所有数据均以（x±s）表示，采用单因素的方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

NF-κB免疫组化阳性产物呈棕黄色颗粒，主要位于肝细胞。对照组可见NF-κB在细胞胞浆弱表达，胞核偶见阳性表达，阳性单位比较低（见图1A）。创伤后，随时间的推移阳性染色增强，于8 h时棕黄色反应物聚集成簇，阳性单位达峰值。12～24 h仍可见大量棕黄色反应物，阳性单位较8h时有所减少（见图1B-D）。经统计学方差分析，各实验组与对照组及与相邻上组的阳性单位比较差异均有统计学意义（P < 0.05），见表1。

3 讨论

NF-κB是一种能与免疫球蛋白kappa链基因的增强子κB序列（GGGACTTTCC）特异性结合的核转录因子。哺乳动物体内NF-κB家族包括RelA（P65）、RelB、C-Rel、NF-κB1（P50/P105）和NF-κB2（P52/P100）五种蛋白[2]，其中以对含量最丰富的p65的研究最为深入，这也是其发挥生物学功能的主要亚单位[3]。

在静息状态下，NF-κB以两种无活性的形式存在于胞浆中，一种是由p50-p65-IκB（inhibitor protein-κB）构成的三聚体，另一种是由p65与p50的前体蛋白p105构成的二聚体[4]。当受到胞外炎症反应、氧化应激、内毒素、创伤、缺血-再灌注等多种伤害性刺激后，IκB激酶（inhibitor protein- kappa B kinase，IKK）被直接激活，诱导IκB的N端调节区某些特定位点的氨基酸残基发生磷酸化和泛素化被降解，IκB的空间构象发生变化，进而与NF-κB的Rel同源区（rel homology domain，RHD）分离，暴露出核定位信号（nuclear localization signal，NLS），NF-κB被激活后，发生胞浆-胞核穿梭（cytoplasmic-nuclear shuttling）[5-7]，与相应的靶基因结合并调节其转录。既往研究发现NF-κB处于多种信号传导通路的汇聚点，具有广泛的生物学活性，在机体的免疫介导、炎症反应、细胞增殖及凋亡调控等多种生理病理过程中发挥重要作用[8-12]。Llacuna L等[13]研究发现NF-κB的双刃剑作用：一方面激发和参与炎症介导，另一方面主要发挥抗凋亡作用，促进细胞再生。在法医学领域，现已证实NF-κB在脑挫伤、皮肤挫伤早期均有较强烈表达[14-15]。

肝脏受到创伤后继发的全身性炎症反应在机体的再损伤过程中发挥重要作用，其发生发展是多因素参与的复杂过程，涉及多个病理学效应。本研究结果提示：肝损伤后NF-κB表达持续增加，8 h达峰值，12～24 h持续高表达并出现下降趋势。因本实验仅局限于24 h内，并未发现其含量恢复至正常水平的现象，但其表达呈现出明显的上升期—高峰期—下降期的表达规律，推测其机制为：对照组有少量的NF-κB表达，可能为维持肝细胞正常生理活动所必需。创伤后肝细胞处于缺血缺氧敏感期，局部血供不足所致的氧化应激可以诱导NF-κB的表达升高，下游基因在受其调控表达释放的同时又作为激动剂进一步作用于NF-κB，如此循环形成以NF-κB为中心的级联放大效应，造成多种细胞因子和炎性介质失控释放，形成表达高峰，加重肝损伤。而在损伤、炎症介质及后期的组织修复中的信号刺激长期存在的情况下，可通过下调NF-κB，阻断其介导的炎症反应通路，从而在一定程度上减少细胞因子和炎症介质的产生及炎症细胞的浸润聚集，缓减肝脏的缺血缺氧性损伤和参与组织修复。

本研究提示NF-κB参与了肝脏损伤、炎症、修复等过程并贯穿始终，其规律性表达为肝脏早期损伤时间的推断提供了新的思路，通过进一步深入研究可望应用于法医学实践。

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（收稿日期：2013-02-05 本文编辑：魏玉坡）