蟾毒灵诱导人胰腺癌细胞凋亡及其对ＴＧＦ－β１表达的影响

【摘要】 目的 研究蟾毒灵对裸鼠人胰腺癌的疗效及细胞凋亡的作用和机理。方法 建立裸鼠人胰腺癌模型，随机分为对照组（NS）、5-氟尿嘧啶组（5-Fu）、蟾毒灵低剂量组（Bu L）、蟾毒灵高剂量组（Bu H）。分别腹腔注射生理盐水 NS，20 ml/kg、5-Fu 24 mg/kg、Bu 1 mg/kg、Bu 1．5 mg/kg。用药后第7天处死，计算肿瘤生长抑制率；TUNEL 法检测瘤体凋亡指数；免疫组化S-P法检测P38、TGF-β1的表达。结果 治疗后与NS组相比，各组瘤体体积均显著缩小（P<0．05）。其中Bu高剂量组瘤体体积明显

结论 蟾毒灵对胰腺癌的生长具有显著的抑制作用并能够诱导人胰腺癌细胞凋亡，抑制TGF-β1的表达。抑制TGF-β1的表达从而诱导胰腺癌细胞凋亡，是蟾毒灵治疗胰腺癌的部分机制。

【关键词】 蟾毒灵；胰腺癌；细胞凋亡；TGF-β1；裸鼠

Study on effect of apoptosis and tGF-β1 expression ofhuman pancreatic cancer cell in nude mice with bufalin

WEN Xiao-ping，LI Qi，LI Xian-qian, et al. Shanghai University of Traditionnal Chinese Medicine. Shanghai 201203,China

【Abstract】

Objective To explore the effect of apoptosis and TGF-β1 axpression ofhuman pancreatic cancer cell in nude mice with Bufalin.Methods Human pancreatic cancer model in nude mice have been established andwere divided into NS group randomly ,5-Fu group, Bufalin（Bu） high dose group, Bufalin low dose group. Normal salin(NS)20ml/kg ,5-Fu 24mg/kg ,Bu1mg/kg ,Bu 1．5mg/kg were injected via transperitoneal approach respectively. After treatment,on the seventh day, nude mice were sacrificed and then the volume of the tumor were compared among all groups. The cell apoptosisindex was tested by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick end labelling technique (TUNEL), TGF-β1 was assayed by immunohistochemical technique (S-P method) and the its mechanism against cancer was discussed initially.Results The tumor volume and growth rate of Bufalin high dose group was significantly smaller than that of other groups (P<0．01). The apoptosis index of Bufalin high dose group was significantly higher than that of other groups (P<0．01), while its TGF-β1 expression was lower than that of other groups.Conclusion The suppressed expression of TGF-β1 could promote the apoptosis, which was one of the mechanism for Bufalin against pancreatic cancer.

【Key words】 Bufalin; Cancer of pancreas; Cell apoptosis;Survivin gene;Rude mouse

蟾毒灵（bufalin,Bu）是传统中药蟾蜍中的蟾毒内酯类成分，分子式为C24H34O4。属强心甙类物质。近年来研究发现具有广泛的抗肿瘤作用^［1，2］。但其治疗胰腺癌尚未见报道，本文观察蟾毒灵对裸鼠人胰腺癌的治疗作用，并从蟾毒灵诱导人胰腺癌细胞凋亡及其对TGF-β1信号转导的影响探讨其治疗胰

腺癌的机制。

1 材料和方法

1．1 实验动物

BALB/C,裸鼠80只，4～5周龄，雌

雄各半，于SPF级动物实验室内的超净生物层流架中恒温无菌饲养。

1．2 主要药物

5-氟尿嘧啶5-Fu注射液（批号：050908，上海旭东海普药业有限公司，10 ml∶0．25 g）、蟾毒灵购自美国Sigma公司，剂型为粉针剂，10 mg/支。

1．3 主要仪器和试剂

CO2恒温培养箱，德国Heraeus Instruments公司；超净工作台，苏州净化仪器厂；倒置显微镜，日本Olympus公司；DMEM细胞培养基干粉，美国GIBCO公司；新生牛血清，500 ml，美国GIBCO公司；胰蛋白酶，美国Sigma公司。

1．4 细胞株来源与培养

人胰腺细胞株SW1 900，由上海中医药大学分子与细胞培养室提供，常规复苏传代培养。在37 ℃, 5% CO2:饱和湿度条件下，培养于含10%灭活的小牛血清、RPMI 1 640培养液中。体外培养至对数生长期时，离心、磷酸盐缓冲液洗涤，配制成1×107个/ml。

1．5 荷瘤小鼠模型的建立 ①细胞接种：取4～6周龄BALB/C 裸鼠5只，体质量(20±2)g，雌雄各半。常规接种裸鼠背部近右上肢皮肤，注入0．2 ml制备好的单细胞悬液，细胞数约为2×106。隔离鼠笼内SPF条件下，恒温恒湿饲养;②组织块接种：经过5～7 d的潜伏期，裸鼠皮下肿瘤生长至1～1．2 cm，将供瘤鼠脱颈椎处死。沿移植瘤包膜小心剥离皮下肿瘤组织。取肿瘤边缘的新鲜肿瘤组织，眼科剪剪成直径1 mm×1 mm×1 mm大小组织块，置于生理盐水中备用。在超净台用20 g套管针接种于裸小鼠背部皮下。受体裸小鼠继续饲养于层流柜中。待皮下肿瘤直径约0．5 cm，即可作为模型用。

1．6 实验分组和给药

荷瘤鼠随机分为4组:生理盐水（NS）组、化疗药(5-Fu)组、蟾毒灵低剂量(Bu L)组、蟾毒灵高剂量(Bu H )组，每组12只，以上各组均为腹腔注射，其中Bu H组1．5 mg/kg；Bu L组为1．0 mg/kg；5-Fu组为24 mg/kg； NS组给予生理盐水20 ml/kg，连续给药6 d，1次/d。

1．7 观察指标及方法 肿瘤生长抑制率：每组取6只，于治疗后第7天处死，游标卡尺测量瘤体最长径(a)和最短径(b),按公式计算肿瘤体积(V)的大小，根据公式V=12ab2计算并比较各组肿瘤生长率。肿瘤生长抑制率:肿瘤生长抑制率=(对照组平均瘤体积-用药组平均瘤体积)/对照组平均瘤体积×100% 。

1．8 小鼠肿瘤凋亡检测 治疗后每组取6只小鼠的肿瘤标本以10%甲醛液固定，石蜡包埋，切片，采用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（Trminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling，TUNEL脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法）。光镜下观察切片的染色反应，结果判断标准^［11］为避开坏死区以细胞核有明显棕黄色为阳性细胞。随机选10个高倍视野(×400)，借助网格记数器，细胞数>1 000个以上，计算TUNEL阳性标记指数（TUNELlabeling index, TUNEL-LI），即凋亡指数。

1．9 肿瘤组织中的TGF-β1检测方法

采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-1过氧化物酶(S-P)方法：石蜡切片脱蜡，柠檬酸盐煮沸热修复法进行抗原修复；加非免疫性动物血清50μl，室温孵育10 min。加一抗caspase-350 μl，4 ℃过夜。加通用型生物素标记羊抗兔IgG 50 μl, 37 ℃孵育15 min。加辣根过氧化物酶标记链亲和素50 μl, 37 ℃孵育15 min。加新鲜配置的DAB溶液100 μl，闭光显色3～10 min，显微镜下控制显色。自来水冲洗，苏木素复染。脱水，透明，中性树胶封固。每批染色均用已知阳性切片作阳性对照，用PBS液代替一抗作阴性对照。显微镜下观察，以细胞核或细胞浆呈棕黄（褐）色为阳性，阳性计数采用双盲法。染色判断标准：p38表达以胞核和(或)胞浆着色为阳性细胞。每张切片于高倍镜下(×400)任选10个视野，计数阳性细胞数（细胞数＞1 000），阳性表达率=(表达阳性细胞数/总细胞数)×100% ^［3］。

1．10 统计方法 用SPSS11．0 统计软件包进行统计学分析，各组数据以均数±标准差(x±s)表示。

2 结果

2．1 各组荷瘤裸鼠肿瘤生长变化

治疗前各组瘤体体积差异无统计学意义(P>0．05 )，提示治疗前各组具有可比性。治疗后，各用药组与NS组相比瘤体体积明显缩小(P<0．05 )；Bu L组与5-Fu 组相比瘤体体积差异无统计学意义(P>0．05 )；Bu H组较其他各组瘤体体积明显缩小（P<0．05），见表1。

2．2 各组对裸鼠人胰腺癌瘤体细胞凋亡的影响

以TUNEL染色中肿瘤细胞核中有棕褐色颗粒者判断为阳性, 即为凋亡细胞。各用药组凋亡指数与NS组相比差异有统计学意义（P<0．01）；5-Fu组与Bu L组相比差异无统计学意义（P>0．05）；Bu H组与5-Fu组和Bu L组相比凋亡指数明显增高（P<0．01） 见表2，图A、D。

2．5 对裸鼠人胰腺癌TGF-β1表达的影响 肿瘤治疗后TGF-β1的表达主要在细胞核或细胞浆中，染色呈棕褐色或棕黄色颗粒。治疗后Bu H组TGF-β1表达明显低于其他各组（P<0．01）。提示蟾毒灵抗癌作用与下调TGF-β1表达从而抑制肿瘤的凋亡有关 见表3。

3 讨论

蟾毒灵（Bufalin）是蟾酥中性能最为优良的抗癌中药成分^［4］。蟾酥是重要的传统抗癌中药，临床用以治疗癌肿，至少有近千年历史。蟾酥具有显著的细胞毒性；在适当剂量内无免疫抑制作用及骨髓抑制作用，与放疗、化疗同用则有减毒增效的作用。

转化生长因子（TGF）β家庭是一类属结构相关蛋白的异二聚体多肽，至少包括三种（TGF-β1~3），其中TGFβ1是人体内的主要形式。TGF-β1为多效能生长因子，有研究显示胰腺癌中TGF-β1的过表达可能与蛋白激酶Ca(PKCa)的膜转运有关,而PKCa的膜表达在多药性耐药中发挥重要作用,检测胰腺癌组织中TGF-β1及PKCa的表达可能有助于对胰腺癌的化疗效果作出评价^［5］。故胰腺癌中TGF-β1的表达异常与胰腺癌的发生发展密切相关。TGF-β1是抑制上皮细胞生长的多肽家庭族中的一员，有丝分裂原诱导的发生凋亡的组织内，TGF-β1前体表达明显增加，外源性的TGF-β1可诱导培养的肝细胞发生凋亡TGF-β1可促进体外培养的肝癌细胞中的DNA降解，TGF-β1通过与靶细胞上的受体结合，引起凋亡的发生。已有的研究发现TGF-β1对胰腺癌细胞凋亡以及细胞周期的具有重要影响这些均提示TGF-β1在细胞凋亡中起作用^［6-8］。

本研究应用不同剂量蟾毒灵治疗人胰腺癌移植瘤裸鼠后，从治疗前后裸鼠人胰腺癌移植瘤生长变化来看，高剂量蟾毒灵组瘤体缩小最明显，而且明显优于单独化疗组和低剂量蟾毒灵组，提示蟾毒灵的抗癌作用与剂量成正相关。本研究中Bu组治疗后的凋亡指数明显升高，同时, 在Bu H组中TGF-β1表达明显低于其他各组, 提示蟾毒灵的抗癌作用与下调TGF-β1表达, 从而促进肿瘤的凋亡有关。根据本研究结果发现，蟾毒灵对人胰腺癌的抑制作用可能是通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡来发挥作用 ,但是其诱导胰腺癌细胞凋亡的明确的信号转导，还需进一步进行深入的研究。

参考文献

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