基因沉默技术在烟草上的应用研究

摘要 病毒诱导基因沉默（virus-induced genetic silencing，VIGS）是携带目的基因片段的病毒侵染植物后，诱导植物体内相同序列基因不表达的现象，它是一种转录后水平的基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）现象。近年来，在烟草基因功能探究和抗病育种的研究中VIGS获得了广泛的应用。阐述了RNA沉默的发现和作用机制，VIGS在烟草基因功能鉴定上的发现和烟草育种上的进展，探讨了VIGS技术在烟草中影响沉默效率的因素、局限性和发展前景。

关键词 基因沉默；VIGS；病毒诱导；基因沉默

中图分类号 Q781 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）08-0013-03

Abstract Virus-induced genetic silencing is the silent phenomenon of plant inner identical sequence gene which is induced by the virus disseminated plant of carried target gene frame.It is a post-transcriptional gene silencing phenomenon（PTGS）.Recently，VIGS technology was used widely in the exploration of tobacco gene function and the research of breeding disease resistance.This review introduced the discovery of RNA silencing and mechanism of action，and described the VIGS technology in the discovery of tobacco gene function and the progress of breeding tobacco.Additionally，the factors that influenced efficiency of silencing，limitation and development prospect of VIGS were studied.

Key words genetic silencing；VIGS；virus-induced；genetic silencing

1 RNA沉默

RNA沉默，即双链RNA能够引发体内同源序列的mRNA特异性和高效率的降解，抑制其内源基因表达。VIGS是RNA沉默中的一种。

1.1 RNA沉默的发现

1990年，Rich Jorgensen等预想在矮牵牛花中过量表达了植物花青素合成的关键酶——查尔酮合酶（Chalcone Synthase，CHS），从而得到产生更多花青素、颜色更深的矮牵牛花，试验结果却产生了完全白色或在紫色上夹杂白色的矮牵牛花，花色发生了明显的褪色。通过对查尔酮合成酶表达量的测定，其浓度比正常矮牵牛花的查尔酮合成酶浓度低50多倍。Jargensen等推测是否外源转入的查尔酮合成酶基因不仅无法在原有基础上大量表达，反而抑制了其内源查尔酮合成酶的表达，从而导致了褪色现象[1]。这种外源基因转入抑制其同源序列内源基因表达的现象被称为共抑制（co-suppression）。

1992年，Ramano和Macino在粗糙链孢霉（Neuros-pcracrassa）中同样观察到了外源基因转入霉菌中，抑制其同源序列内源基因表达的现象，称为基因抑制（Quelling）[2]。

1995年，Guo和Kemphues在线虫中观察到，导入线虫体内的反义RNA会和内源的mRNA结合形成双链RNA从而被降解，相似正义RNA导入线虫体内，同样也被内源mRNA降解[3]。

1998年，Andrew Fire和Mello将双链RNA（double-strand RNA，dsRNA）正义链和反义链同时注入线虫，发现同时注入正义链或反义链比单独注入能更有效地抑制基因的表达，由此推断双链RNA是引起基因沉默的主要原因，并称这种由于双链RNA引起的基因沉默现象为RNA干扰（RNA interference，RNAi）[4]。

RNA沉默在真核生物中普遍存在，特别是低等动植物以及微生物。RNA沉默现象在不同领域里名称不同，如植物中的共抑制、真菌中的基因抑制、动物中的RNA干扰，其本质都是转录后的基因沉默。

1.2 RNA沉默现象的机理

人们提出了RNA阈值模型、异位配对和双链RNA模型等假说来解释RNA沉默产生的机制，其中双链RNA模型是被人们普遍接受的假说。双链RNA（dsRNA）是病毒复制过程中的中间体，也被认为是引起RNA沉默的关键因子，一般伴随病毒在寄主体内复制而产生[5]。当外源核酸进入寄主体内并积累一定量，可以特异性地被Dicer（属于RNaseⅢ核酶家族成员）识别后与双链RNA结合，并将其剪成21～23 nt片段的小分子RNA（small interfering RNA，siRNA）。siRNA随后与RNA解旋酶、核酸内切酶RNase组成RNA沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，在ATP的参与下解旋成单链RNA，使得RISC成为活性复合体，在RISC的介导下与具有反向序列的靶mRNA特异结合，从而导致mRNA的降解并抑制其翻译，阻止了靶向基因蛋白质和多肽的合成[6]。mRNA被切割，产生更多的21～23 nt的小片段，这些小片段又可以与siRNA重新产生新的结合，最后表现出基因沉默。这一机制是不断放大的，一旦启动就能加速进行，而这些21～23 nt的小片段也能很容易在细胞间进行远距离的移动扩大抑制范围[7-8]。