遗传性非息肉病性结直肠癌的分子病理研究

[摘要] 目的 研究遗传性非息肉病性结直肠癌的分子病理特征，评估该病在北京地区住院人群中的发病情况。 方法 94例结直肠癌组织标本均采集自2012年3～9月于北京市中西医结合医院及解放军总医院住院接受手术治疗并经病理确诊为结直肠癌的患者。使用免疫组化方法对肿瘤组织内错配修复基因MLH1、MSH2、MSH6及PMS2的蛋白表达情况进行检测。 结果 94例结直肠癌患者中，至少有一种错配修复基因表达为阴性的共有13例，其中MLH1表达为阴性的有3例，MSH2表达为阴性的有11例，MSH6表达为阴性的有2例，PMS2表达为阴性的仅有1例，遗传性非息肉病性结直肠癌的发病率为13.83%，MSH2基因突变所占比例达84.62%，与遗传性非息肉病性结直肠癌国际合作组织提供的数据（40%）相比，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 北京地区住院的结直肠癌患者中，遗传性非息肉病性结直肠癌发病率高于世界每年新发病例的水平，且MSH2基因突变致病尤为突出。

[关键词] 遗传性非息肉病性结直肠癌；免疫组化；错配修复基因

[中图分类号] R735.35 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）10（c）-0023-04

Molecular pathological character of hereditary nonpolyposis colorectal cancer

NIE Chen1 LI Yueting1▲ ZHAO Baojian2 GAO Lei3 YAN Jin2 WANG Junyi3

1.Department of Surgery， Beijing Hospital of Integrated Traditional and Western Medicine， Beijing 100039， China； 2.Beijing DBIO Molecular Diagnosis Institute， Beijing 100097， China； 3.Beijing Jingmeng Stem Cell Technology Co. Ltd.， Beijing 100085， China

[Abstract] Objective To study the molecule pathological characteristics of hereditary nonpolyposis colorectal cancer and to evaluate the morbidity of this disease among in-patients in Beijing. Methods 94 samples of colorectal cancer tissue were all collected from the patients who accepted operations in Beijing Hospital of Integrated Traditional and Western Medicine and the General Hospital of Chinese People"s Liberation Army from March to September 2012， and afterward diagnosed as colorectal cancer by pathology. Immunohistochemistry was applied in detecting the protein expressions of mismatch repair gene MLH1， MSH2， MSH6 and PMS2 in the cancer samples. Results Among 94 colorectal cancer samples， 13 samples suggested negative expression of at least one mismatch repair gene， wherein 3 samples had negative MLH1 expression， 11 samples had negative MSH2 expression， 2 samples had negative MSH6 expression， and only one sample had negative PMS2 expression. Hereditary nonpolyposis colorectal cancer had a morbidity of 13.83%. The percentage of MSH2 mutation reached 84.62%， which showed a statistical difference to the data （40%） provided by the International Collaborative Group on hereditary nonpolyposis colorectal cancer （P < 0.05）. Conclusion Among colorectal cancer in-patients in Beijing， hereditary nonpolyposis colorectal cancer has a higher morbidity than the average level of annual new cases in world， especially out of MSH2 gene mutations.

[Key words] Hereditary nonpolyposis colorectal cancer； Immunohistochemistry； Mismatch repair gene

遗传性非息肉病性结直肠癌（hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC）是由于错配修复基因（mismatch repair gene，MMR）发生种系突变所导致的一种综合征。Hey Lynch最早描述了遗传性癌症综合征的临床特征[1]，故而HNPCC又称为Lynch综合征。HNPCC的特征为结肠癌和其他肿瘤（如子宫内膜癌、卵巢癌、胃癌、小肠癌、肝胆系统肿瘤、上泌尿道肿瘤、脑部肿瘤和皮肤癌等）发病风险较高。自1990年起，HNPCC国际合作组织及许多国家发布了多个HNPCC家族的临床筛选标准[2-5]，我国也于2004年发布了中国人遗传性大肠癌的筛检标准[6]。多年来的临床实践和研究表明，临床诊断标准难以兼顾敏感性和特异性，将漏诊错诊大量病例[7]。因此我国在发布家系筛选标准的同时，还发布了分子病理的筛检策略，以弥补临床筛检策略的不足，包括MLH1和MSH2的免疫组化检测、MSI检测和基因测序等[6]。

目前国内外公认MMR基因外显子测序为诊断HNPCC的金标准，但由于成本高、耗时长、技术难度高，不利于其推广应用。有研究报道免疫组化检测MMR基因突变的敏感性（77%～97%）及特异性（89%～100%）均较高[8]，能够直接反映出MMR蛋白表达情况，且在全国各大医院均可开展，因此通过免疫组化筛查HNPCC患者是一种行之有效的方案[9]。本课题通过对北京地区94例结直肠癌患者的肿瘤组织进行免疫组织化学染色，观察MLH1、MSH2、MSH6及PMS2四个MMR基因的蛋白表达情况，研究北京地区住院人群HNPCC的分子病理特征，评估北京地区住院人群HNPCC的发病情况。

1 材料与方法

1.1 材料来源

94例结直肠癌组织标本均采集自2012年3～9月于北京市中西医结合医院及解放军总医院住院接受手术治疗并经病理确诊为结直肠癌的患者。

1.2 免疫组化

1.2.1 试剂与仪器 MLH1和MSH2一抗购自Novocastra公司，MSH6和PMS2一抗购自Epitomics公司。光学显微镜购自奥林巴斯公司，型号为CX31。

1.2.2 实验方法 采用免疫组织化学的方法检测肿瘤组织内MLH1、MSH2、MSH6及PMS2蛋白的表达。操作步骤如下：将肿瘤组织蜡块连续切片（厚度约4 μm），放入70℃烤箱烤片1 h。梯度脱蜡：二甲苯脱蜡3次各10 min；无水乙醇脱蜡3次各5 min；95%乙醇脱蜡2次各2 min；80%乙醇脱蜡2 min。自来水、蒸馏水冲洗各20 s。放入3%过氧化氢水溶液10 min。自来水、蒸馏水冲洗各20 s，放入PBS缓冲液中。组织修复采用高温高压法：待高压锅内修复液沸腾后，放入切片，盖紧高压锅盖，待高压锅阀门喷气开始计时，修复时间为2 min。修复液为pH 8.0的EDTA缓冲液。切片取出后放入PBS缓冲液中充分洗涤3次，每次3 min。取出切片，擦干组织周围液体后滴加一抗，放入4℃冰箱内过夜。切片放入PBS缓冲液中清洗3次，每次3 min，充分洗涤。滴加二抗，室温孵育20 min。切片放入PBS缓冲液内洗涤3次，每次3 min，充分洗涤。进行DAB显色。苏木精复染细胞核。分化、返蓝。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.3 结果判定标准

参照Friedrichs等[10]的免疫组化评判标准，采用半定量积分法，分别观察染色强度和阳性细胞所占百分数。在40倍镜下连续观察10个视野，先按染色强度计分（染色深浅需与背景着色相对比），0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄，3分为棕褐色。再按阳性细胞占所观察细胞的百分比打分，0分为阴性，1分为阳性细胞≤10%，2分为阳性细胞>10%～50%，3分为阳性细胞>50%～80%，4分为阳性细胞>80%。将染色强度与阳性细胞百分比计分相乘，乘积≥2分为蛋白表达正常（阳性），乘积等于1分为蛋白低表达（弱阳性）、乘积等于0分为蛋白表达缺失或蛋白表达异常（阴性），蛋白低表达和蛋白表达缺失均按阴性表达进行统计。阳性对照为内部核染色阳性的良性肠上皮和（或）淋巴细胞。结直肠癌组织中至少有一种MMR蛋白表达为阴性，即发生突变，则将该患者定义为HNPCC患者。

1.4 统计学方法

所有数据均应用SAS 8.2统计软件分析，计数资料比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在94例结直肠癌组织中，至少有一种错配修复基因表达为阴性的（即HNPCC患者）共有13例，占13.83%。MLH1蛋白表达为阴性的有3例，占HNPCC患者的23.08%；MSH2蛋白表达为阴性的有11例，占84.62%；MSH6蛋白表达为阴性的有2例，占15.38%；PMS2蛋白表达为阴性的有1例，占7.69%。MSH6蛋白表达阴性的2例均伴有MSH2蛋白表达阴性。PMS2蛋白表达阴性的1例同时伴有MLH1和MSH2蛋白表达阴性。见表1。

3 讨论

国际癌症研究机构公布的统计数据显示[11]，2008年全世界有1270万人患癌症，760万人死于癌症。2009年，我国结直肠癌的发病风险在男性中排第4位，在女性中排第2位[12]。结直肠癌是一种有遗传倾向的肿瘤，世界每年新发的结直肠癌病例中，约15%是家族性的，约10%是遗传性的[9]，HNPCC是最常见的一种遗传性结直肠癌，占每年新发病例的2%～5%[9]。本研究结果显示，在北京地区住院治疗的94例结直肠癌患者中，有13例表现出MMR蛋白表达缺失，可诊断为HNPCC，发病率达13.83%，高于世界每年新发病例的水平。

HNPCC主要由于MMR基因发生种系突变所致。DNA的MMR基因系统能够识别纠正DNA复制过程中出现的碱基对错配和微小的插入或删除。MMR基因的两个家族MutS（MSH2、MSH3、MSH6）和MutL（MLH1、MLH3、PMS1和PMS2）表达的蛋白形成异二聚复合体，协同作用介导修复错配DNA的过程[13-14]。在此过程中，MSH2起识别绑定错配DNA的作用。MSH6和MSH3分别与MSH2形成MutSα和MutSβ复合体，募集MutLα（由MLH1和PMS2构成）和MutSβ复合体（由MLH1和PMS1构成），介导错配基因识别和酶切修复过程。因此，MLH1蛋白和MSH2蛋白是构成错配修复蛋白异二聚复合体的必备蛋白。尽管MSH6蛋白和PMS2蛋白表达缺失会影响错配修复蛋白异二聚复合体的构成，但其他蛋白（如MSH3、MLH3及PMS1等）可与MLH1蛋白或MSH2蛋白结合，起到一定的代偿作用[7]。

HNPCC国际合作组织对来自全球500多个HNPCC患病家族的300多个不同的致病基因突变的数据进行汇总统计，该基因突变数据库显示[15]：大多数的突变影响了MLH1和MSH2两个基因，因为这两个基因的蛋白质产物是参与修复错配DNA必不可少的成分；在所有MMR基因突变中，MLH1突变约占50%，MSH2突变约占40%，MSH6突变约占10%，而PMS2突变仅约占2%。本研究的结果与该数据库统计信息相比，在北京地区住院的HNPCC患者中，MLH1基因突变比例相对较低，MSH2、MSH6和PMS2基因突变比例均相对较高，但仅有MSH2基因突变所占比例的差异有统计学意义（P < 0.05）。在发生MMR基因突变的13例中，仅1例为PMS2突变，且与MLH1和MSH2同时突变，这与Gill等[16]报道的PMS2单独突变率较低的结论相符。

MSH2突变与HNPCC的肠外肿瘤高发有关。Vasen等[17]的研究表明，MSH2突变基因携带者罹患子宫内膜癌的风险（61%）比MLH1突变基因携带者（42%）高，但差异不明显；MSH2突变基因携带者患泌尿道肿瘤、胃癌和卵巢癌的相对风险明显增高。在本研究中，MSH2突变致病的比例高达84.62%，提示北京地区HNPCC患者罹患肠外肿瘤的风险较高。

本研究以免疫组化方法检测MLH1、MSH2、MSH6和PMS2四种MMR蛋白的表达情况，发现北京地区住院的结直肠癌患者中，HNPCC发病率高于世界每年新发病例的水平，且MSH2基因突变致病尤为突出。因此，在临床上对HNPCC应高度重视，有效地筛查出HNPCC患者[18-20]。

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（收稿日期：2014-06-21 本文编辑：张瑜杰）