血小板衍生生长因子—BB、转化生长因子—β1联合应用对大鼠正畸牙牙周膜中整合素β3表达的影响

[摘要] 目的 观察大鼠正畸牙局部联合应用血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）和转化生长因子-β1（TGF-β1）后正畸牙牙周膜中整合素β3表达的变化。方法 按随机数字表法，将32只大鼠随机均分为4组。建立大鼠上颌第一磨牙近中移动正畸模型，隔日于施力磨牙颊侧牙龈黏膜下分别注射1%PBS、10 ng PDGF-BB、5 ng TGF-β1、10 ng PDGF-BB和5 ng TGF-β1叠加剂量，注射体积均为0.1 mL。加力10 d后处死动物，取左上颌第一磨牙及其牙周组织，用免疫组织化学方法检测牙周组织中整合素β3的表达，进行阳性表达区域平均光密度值测量，对测量结果行方差分析，服从正态分布，再行组间t检验统计学分析。结果 各实验组压力侧牙周膜细胞中整合素β3的表达强度均高于对照组（P<0.01），其中PDGF-BB+TGF-β1组与TGF-β1组或PDGF-BB组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。实验组张力侧牙周膜细胞中整合素β3的表达强度均高于对照组（P<0.05），其中PDGF-BB+TGF-β1组整合素β3表达强度较强，与TGF-β1或PDGF-BB组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论 局部联合应用外源性PDGF-BB和TGF-β1对大鼠正畸牙牙周组织中整合素β3的上调作用较单独运用PDGF-BB或TGF-β1组强，二者联合应用有协同效应，共同促进了正畸牙周组织改建。

[关键词] 转化生长因子-β1； 血小板衍生生长因子-BB； 整合素β3； 正畸牙牙周组织

[中图分类号] Q 257 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.04.022

整合素是一种广泛存在于各种细胞表面的跨膜糖蛋白受体，负责将细胞外基质承载的信号经复杂的通路转导入细胞内，对细胞的形态、运动、存活和增殖产生重要调控作用。研究[1]表明整合素在正畸牙牙周组织改建中具有调节、激活各种牙周组织细胞的功能，其中αvβ3在破骨细胞中的表达水平最强，是调节破骨细胞功能最重要的整合素。另有研究[2]证明整合素在细胞膜上的表达水平又受许多细胞因子的调控。目前研究最多的上调因子有：转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β、血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、白细胞介素（interleukin，IL）等。本课题组前期实验在正畸牙局部注射单一生长因子PDGF或TGF-β1后，发现当生长因子在一定的剂量浓度范围内，可上调正畸牙牙周组织上整合素αvβ3的表达，牙周组织改建活跃[3-4]。近年来研究[5]显示牙周组织改建是在多种生长因子共同的网络调节作用下实现的，不同生长因子联合应用存在协同或拮抗作用，并在不同的浓度范围呈刺激或抑制作用。因此本实验拟建立大鼠正畸牙移动模型，通过对比观察生长因子PDGF-BB和TGF-β1单独或联合运用于大鼠正畸牙局部后，正畸牙牙周组织中整合素β3表达的变化，可望通过生长因子联合运用上调整合素的表达进而影响正畸牙牙周组织改建速率。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和设备

PDGF-BB冻干粉和TGF-β1冻干粉（Peprotech 公司，美国），兔抗人整合素β3多克隆抗体浓缩液（Chemicon公司，加拿大），即用型SABC免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），Image-pro plus图像分析系统（Media Cybernetics公司，美国），镍钛螺旋拉簧（杭州新亚齿科材料有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立及生长因子注射 选用健康成年雄性SD大鼠32只（第三军医大学实验动物中心提供），体重200～250 g。在SD大鼠左上颌第一磨牙和上中切牙间安装镍钛螺旋拉簧，上颌两切牙联扎固定作为支抗牙牵引左侧上颌第一磨牙近中移动，用测力计测量拉簧拉力0.5 N。按随机数字表法，随机将32只大鼠分为4组：对照组（PBS组）、PDGF-BB组、TGF-β1组、PDGF-BB+TGF-β1组，每组8只。加力1、3、5、7、9 d在正畸牙的颊侧牙龈黏膜下按分组不同分别注射含1%PBS、10 ng PDGF-BB、5 ng TGF-β1、10 ng PDGF-BB和5 ng TGF-β1叠加剂量，体积均为0.1 mL的液体。

1.2.2 标本获取 实验加力第10天处死大鼠，多聚甲醛透心灌注，取左上颌第一磨牙以及牙周组织，置于乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）脱钙液（pH7.4）中浸泡脱钙。修整标本，使腭侧基本与第一磨牙牙体长轴平行，系列乙醇脱水，二甲苯置换，石蜡包埋时标本腭侧朝下，将标本按磨牙近远中向切片，片厚5～6 μm。每个标本连续切片5张，用于免疫组织化学检测。

1.2.3 整合素β3的免疫组织化学检测 选取石蜡切片，常温脱蜡至水；切片于3%甲醇过氧化氢中避光处理15 min，阻断内源性过氧化物酶；滴加5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封闭液，室温孵育20 min；滴加稀释的一抗各20 μL，4 ℃冰箱过夜；滴加生物素化羊抗兔IgG，37 ℃孵育15～20 min；滴加SABC，37 ℃孵育15～20 min；加20 μL DAB显色剂，显微镜下控制显色90 s；苏木素衬染3 min，中性树胶封片。

1.2.4 图像分析和定量统计分析 用image-pro plus图像分析系统对各组牙周组织中整合素β3免疫组织化学染色强度进行测量。具体方法为：选取每个标本各检测指标切片5张，每张切片在牙根的压力和张力侧除根尖1/3以外区域分别随机取10个视野（×400）进行光密度值测量，在每个视野内截取牙周膜区域测量阳性信号强度的平均光密度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件对实验数据进行分析，对各组阳性区域的平均光密度值进行方差分析，若服从正态分布且方差齐，再采用组间t检验进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组牙周组织中整合素β3的表达情况见图1。由图1可见，PDGF-BB+TGF-β1组牙周组织改建活跃，大鼠正畸牙牙周组织中牙周膜压力侧因挤压而紧缩，牙周膜间隙变窄，新生的毛细血管，牙槽骨骨壁可见骨吸收陷窝和破骨细胞。张力侧牙周间隙变宽，牙周膜中纤维排列疏松，细胞成分增多，可见大量扩张充血的血管，牙槽表面可见较多的成骨细胞。牙周膜细胞上整合素β3呈阳性表达，成纤维细胞、成骨细胞、血管内皮细胞胞浆及胞膜均呈淡棕黄色着色；破骨细胞胞膜和胞浆上高表达，出现较深的棕褐色着色。与对照组相比，实验各组整合素在牙周膜上表达均呈范围较广和强度较高的表现。其中PDGF-BB+TGF-β1组整合素β3表达区域最为广泛，且破骨细胞上表达最强，细胞的胞浆和胞膜上呈现深褐色染色，破骨细胞数量也相应增多。

对照组、TGF-β1组、PDGF-BB组、PDGF-BB+

TGF-β1组压力侧牙周膜细胞中整合素β3的平均光

密度值分别为0.021 7±0.006 8、0.045 6±0.005 4、0.044 3±0.004 9、0.061 3±0.002 7。统计学分析表明：各实验组压力侧牙周膜细胞中整合素β3的表达强度均高于对照组（P<0.01），PDGF-BB+TGF-β1组整合素β3表达强度最强，与TGF-β1组和PDGF-BB组比较差异有统计学意义（P<0.01）；而PDGF-BB组与TGF-β1组整合素β3表达的平均光密度值差异无统计学意义（P>0.05）。

对照组、TGF-β1组、PDGF-BB组、PDGF-BB+

TGF-β1组张力侧牙周膜细胞中整合素β3的平均光密度值分别为0.020 8±0.001 4、0.034 5±0.003 8、0.032 4±0.002 5、0.037 2±0.003 6。统计分析表明：实验组张力侧牙周膜细胞中整合素β3的表达强度均高于对照组（P<0.05），其中PDGF-BB+TGF-β1组整合素β3表达强度较强，但与TGF-β1或PDGF-BB组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

正畸牙周组织改建是一个复杂的过程，破骨细胞的破骨作用和成骨细胞的成骨作用是牙周组织改建的基础。在众多的影响因素中，各种生长因子、细胞因子调节着成骨细胞和破骨细胞的功能，为维持骨改建的平衡发挥了关键作用[6]。其中生长因子TGF-β已被证明在一定时间和浓度范围内能显著促进牙周膜细胞增殖，呈时间和剂量依赖关系[7]。生长因子PDGF-BB则可通过其受体直接促进体外培养的破骨细胞的骨吸收功能，刺激牙周膜成纤维细胞的增殖、趋化性和有丝分裂活性[8]。本课题组前期实验中已证实了将低剂量的PDGF-BB或TGF-β1单独注射于大鼠正畸牙局部，在加力10 d时牙周膜细胞上αvβ3表达、压力侧破骨细胞计数均为峰值，对牙周组织改建有明显的促进作用，加速了正畸牙的移动[3-4]。Dennison等[9]对牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞的体外培养发现人TGF-β对人牙周膜细胞的作用，结果表明TGF-β促进细胞增殖，在0.1～20 μg·L-1范围内表现为浓度依赖效应，且与PDGF联合应用时二者有协同效应。吉建新等[10]发现PDGF-BB或TGF-β单独运用均促进了牙周膜细胞的增殖，并在最佳效应浓度PDGF-BB 10 ng和TGF-β 5 ng联合应用时，发现二者有协同作用，有非常明显的促进人牙周膜细胞增殖效果。故本实验在前期实验的基础上，将TGF-β1与PDGF各自的最佳剂量叠加作为实验局部注射剂量，探讨两种生长因子叠加运用对牙周组织改建过程中整合素αvβ3的影响。

整合素是一类广泛存在于细胞表面的蛋白质，由α和β亚基构成的异二聚体跨膜糖蛋白。介导细胞和细胞外基质（extracelluar matrix，ECM）及细胞间的粘连，参与细胞内外信息的传递[11]。包含β3亚单位的整合素异二聚体有2种：αvβ3和αⅢbβ3，其中αvβ3主要表达在破骨细胞和成骨细胞上；而αⅢbβ3主要表达于血小板，成骨细胞和破骨细胞上无表达 [12]。故本研究对牙周组织上整合素β3的检测可以近似认为是对αvβ3的检测，讨论中提到的整合素均为αvβ3。αvβ3在破骨细胞上的表达水平最强，是调节破骨细胞功能最重要的整合素[13]。整合素介导的破骨细胞黏附过程，对破骨细胞分化和成熟、破骨细胞的募集和活化以及骨吸收功能起着重要作用。破骨细胞要发挥骨吸收作用，首先要与骨基质蛋白（骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白和纤连蛋白）黏附，这个过程由整合素介导，使其黏附于骨表面发挥骨吸收作用[14-15]。Talic等[16]研究发现正畸牙移动过程中整合素αvβ3在破骨细胞表面大量表达，发挥着促进骨吸收的作用。因此破骨细胞上αvβ3的表达情况可以反映破骨细胞发挥骨吸收作用的能力，对破骨细胞上表达的整合素的检测可初步推断牙周组织破骨情况是否活跃。本实验结果显示，在正畸牙牙周膜细胞上整合素β3呈阳性表达，PDGF-BB+TGF-β1组整合素β3表达区域最为广泛，且破骨细胞上表达最强，细胞的胞浆和胞膜上呈现深褐色染色，破骨细胞数量也相应增多。可初步推断两种生长因子联合运用，未产生拮抗作用，两者相互协同、刺激作用上调了整合素αvβ3 的表达，进而使破骨细胞功能活跃，共同促进了牙周组织改建。

整合素αvβ3在血管形成中也发挥着重要作用。整合素αvβ3在活化的血管内皮细胞中高表达，参与血管内皮细胞的增殖、迁移、黏附，向细胞内传导生存信号，抑制凋亡[17]，与多种参与血管形成的因子如PDGF、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）等协同促进新生血管形成[18]。正常情况下整合素无活性，需在激素、细胞因子、ECM等刺激下其构型和亲和力发生改变而具活性。多个报道表明整合素可与生长因子受体连接形成复合物，信号转导通路也在多个环节发生重叠。生长因子间相互发生协同作用的同时，生长因子和整合素之间发生交叉对话调控着许多细胞生物学过程[19]。生长因子信号能促进整合素信号发生转导。在生长因子刺激下黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）通过N末端FERM域与生长因子受体相互作用，另外通过C末端FAT域与衔接蛋白paxillin及talin结合并且聚到整合素周围，这样在整合素信号系统与生长因子受体之间架起了一座桥[20]。用整合素抗体可阻断生长因子介导的信号转到通路。目前，有关生长因子和整合素之间的对话现象研究较多的因子有PDGF、TGF-β、胰岛素样生长因子-1等[21]。本实验结果显示局部联合应用PDGF-BB+TGF-β1后，牙周组织中压力侧、张力侧整合素αvβ3的表达均呈增强趋势。可初步推测本实验中两种生长因子联合运用，产生协同作用，可能共同促进了整合素信号转导，上调了牙周膜细胞表面整合素αvβ3的表达。整合素αvβ3表达增加又促进血管内皮细胞分裂、增殖及活化，加快了毛细血管新生，从而改善牙周组织的血液循环。新生血管形成又是支持成骨细胞成骨所必需的，进而可能促进了张力侧成骨活动，有利于牙周组织的改建。

随着利用多种生物活性因子之间的协同作用，加速诱导牙周组织改建的研究不断深入。研究整合素和生长因子协同调节的生化信号，将有助于揭示生理状态下的细胞生物学过程，本研究仅从整合素表达方面检测了生长因子联合运用的协同作用，但生长因子间具体协同机制和相关的信号通路有待进一步的实验明确。同期实验已证明生长因子TGF-β1与PDGF联合应用于大鼠正畸牙周组织压力侧破骨细胞计数明显增多，加速了正畸牙移动[22]。与本实验共同说明了该两种生长因子联合运用对正畸牙周组织改建有协同促进作用。

近年来富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）促进骨修复和牙周组织再生已成为研究热点。PRF是一种富含细胞因子和生长因子的自体来源的新型生物材料，其分子结构类似天然血凝块，浓缩的血小板被激活后可以释放多种生长因子，以TGF-β和PDGF含量较高[23]。PRF完全取自自体血，未添加任何生物制剂，安全可靠，使得PRF具有较好的应用前景和价值。相信随着相关生长因子生物支架材料技术的不断成熟，各种生长因子能缓慢释放，并保持有效浓度。生长因子复合材料将有望运用于正畸临床，共同促进牙周组织改建作用，加速正畸牙移动，缩短正畸矫治疗程。

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（本文编辑 杜冰）