心脉隆注射液对ADP和花生四烯酸诱导血小板聚集的影响

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【摘 要】 目的：观察心脉隆注射液（XML）对血小板聚集的影响。方法：使用血小板聚集仪观察不同浓度的XML对二磷酸腺苷（ADP）和花生四烯酸（AA）诱导血小板聚集的影响，及是否诱导正常血小板聚集。结果：1 g/L的XML能显著抑制ADP诱导的血小板聚集，抑制率为7.8%;1 g/L和0.5 g/L的XML也明显抑制AA诱导的血小板聚集，抑制率分别为57.7%和20.5%;所有浓度的XML均不能直接诱导血小板聚集。结论：XML能剂量依赖性地抑制不同诱导剂引起的血小板聚集，且对ADP诱导血小板聚集的抑制作用强于AA。

【关键词】 心脉隆注射液;血小板聚集;二磷酸腺苷;花生四烯酸

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2019）21-0012-04

Influence of Xinmailong Injection on ADP and Arachidonic Acid-induced Platelet Aggregation

HAN Yajuan1 YANG Zekang1 WANG Mengdie1 SHEN Lei1，2*

1.College of Pharmacy and Chemistry， Dali University， Dali 671000， China;

2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D， Dali 671000， China

Abstract：Objective To observe the influence of XML on platelet aggregation. Methods The influences of different concentration of XML on ADP and Arachidonic Acid （AA）-induced platelet aggregation， or on normal function of platelet were evaluated by platelet aggregation analyzer. Results 1 g/L XML significantly inhibited ADP-induced platelet aggregation with 7.8% inhibition rate; 1g/L and 0.5g/LXML obviously inhibited AA-induced platelet aggregation with 57.7% and 20.5% inhibition rate， respectively. All concentrations of XML could not induce platelet aggregation. Conclusion XML dose-dependently inhibited platelet aggregation induced by different inducers， and the inhibitory effect of XML on platelet aggregation induced by ADP was stronger than that induced by AA.

Keywords：XinMailong Injection; Platelet Aggregation; Adenosine Diphosphate; Arachidonic Acid

異常血栓形成是很多心脑血管疾病的起因，如脑中风、心肌缺血和动脉粥样硬化[1]。在血栓形成的过程中，血管受损会激活血小板、引起其粘附和聚集并与纤维蛋白相互作用[2]。因此，血小板聚集是血栓形成的重要事件，其功能失调会促进血栓性疾病的发展，而抗血小板聚集的药物是治疗心脑血管疾病的重要手段。

心脉隆注射液（Xinmailong injection，XML）是用美洲大蠊提取的生物活性物质制成，主要活性成分是一些小分子肽和氨基酸，为国家二类新药，用于治疗慢性心力衰竭，适应症为心功能的C期、D期，临床上无明显不良反应，可安全使用[3]。近年来发现XML在心脑血管疾病中有广泛的药理活性，如对缺血性脑中风急性期有一定的治疗作用，减少脑梗死面积[4];对急性脑梗死合并慢性心力衰竭有辅助作用[5];減轻氧化应激损伤血管平滑肌[6];抑制缺血缺氧后心肌细胞的凋亡[7];对抗动脉粥样硬化，降低血清胆固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白[8]，还能保护受到动脉粥样硬化损伤的血管内皮细胞[9]。在这些疾病中均有血小板聚集的异常，而目前未见XML对血小板聚集作用的报道。因此，本实验采用体外实验考察XML对二磷酸腺苷（Adenosine diphosphate，ADP）和花生四烯酸（Arachidonic acid，AA）诱导血小板聚集的作用，并探讨XML对正常血小板是否有影响，以此了解XML对心脑血管疾病的作用是否与血小板功能有关。

1 材料

1.1 实验动物 SD大鼠购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，SPF级，雄性，体质量280～320 g，许可证号：SCXK（湘）2016-0002。

1.2 药物与试剂 心脉隆注射液（批号：1703124，云南腾药制药股份有限公司）;一次性采血管（含129 mmol·L-1枸橼酸钠，批号：180906，浏阳市三力医用科技发展有限公司）;二磷酸腺苷（ADP，批号：716E022）和花生四烯酸（AA，批号：513B023）均购自北京索莱宝科技有限公司;替卡格雷（批号：C10061222，上海麦克林生物技术公司）;阿司匹林（批号：H172201，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.3 仪器 Agg RAMTM型血小板聚集仪（美国Helena公司）

2 方法

2.1 XML对ADP诱导血小板聚集的作用 取SD大鼠，10%水合氯醛（3mL/kg）麻醉后，分离腹主动脉用含129 mmol/L枸橼酸钠的采血管取血，800 rpm，离心10 min后吸取上层的富含血小板血浆（PRP），下层血浆再经3500 rpm，离心10 min后吸取上层的贫含血小板血浆（PPP）。用PPP调整PRP至血小板数目为200×109个/L。将PRP随机分为4组：溶剂对照（生理盐水）组，阳性药替卡格雷（0.05 g/L）组，XML 1、0.5 g/L组。将各组药物加入PRP中（37 ℃）混匀孵育5 min，再加入ADP（10 μmoL/L）诱导血小板聚集，于血小板聚集仪中记录血小板聚集曲线及血小板的最大聚集率，计算药物对血小板聚集的抑制率 = （溶剂对照组血小板最大聚集率-药物组最大血小板聚集率）/溶剂对照组血小板最大聚集率×100%。

2.2 XML对AA诱导血小板聚集的作用 同上制备PRP和PPP，调整PRP至血小板数目为500×109个/L，同上对PRP分组，阳性药为0.1 g/L的阿司匹林，诱导剂为AA（0.5 mmoL/L）。药物孵育PRP后加入AA诱导血小板聚集，记录血小板的最大聚集率，计算药物对血小板聚集的抑制率。

2.3 XML对正常血小板的作用 制备PRP和PPP，调整PRP至血小板数目为200×109个/L，将PRP随机分为4组：溶剂对照（生理盐水）组，XML高、中、低浓度组（1、0.5、0.25 g/L）组。用药物孵育PRP后，直接记录血小板聚集曲线和血小板最大聚集率，观察XML对正常血小板的作用。

2.4 统计学处理 使用SPSS 13.0软件进行统计学分析，数据用均数加减标准差（x±s）表示，多组间均数比较使用one-ANOVA分析，并检验方差是否齐性，若方差齐性，使用LSD法比较两组间差异，若方差不齐，使用Dunnett T3法比较两组间差异。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 XML抑制ADP诱导的血小板聚集 与溶剂对照组相比，1 g/L的XML能显著性抑制ADP诱导的血小板聚集，差异有统计学意义（P<0.01），抑制率为7.8%;而0.5g/L的XML作用不明显，差异无统计学意义（P>0.05）。阳性药替卡格雷抑制ADP致血小板聚集作用非常明显（P<0.01），抑制率高达77.4%。结果见图1和表1。

3.2 XML抑制AA诱导的血小板聚集 XML抑制AA诱导血小板聚集的作用要优于抑制ADP对血小板聚集的诱导作用。与溶剂对照组相比，1 g/L和0.5 g/L的XML均能显著性抑制AA诱导的血小板聚集，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.01），抑制率分别达到为57.7%和20.5%。与1 g/L的XML相比，阳性药阿司匹林也能明显抑制AA诱导的血小板聚集（P<0.01），抑制率为57.4%。结果见图2和表2。

3.3 XML诱导血小板聚集 由图3、表3可知，直接加入XML不能诱导血小板聚集。与溶剂对照组相比，加入1 g/L、0.5 g/L和0.25 g/L的XML后，血小板的最大聚集率均无明显改变，差异无统计学意义（P>0.05）。

4 讨论

血管损伤后，很多活性物质从内皮细胞释放，趋化血小板粘附于受损部位，并与相应的表面受体结合活化血小板。活化的血小板释放储存的物质，如ADP、血清素、血小板活化因子、AA诱导的血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）等，启动并促进血小板聚集。诱导血小板聚集的共同通路为引起细胞内Ca2+浓度增加来激活血小板膜上的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa[10-13]。本实验中，心脉隆注射液（XML）对ADP和AA诱导的血小板聚集均有浓度依赖性的抑制作用，而对AA介导途径的作用明显强于ADP介导途径，这可能与XML调节AA途径中的几个重要因子有关。有研究表明，XML能对抗动脉粥样硬化对血管内皮细胞的损伤，升高动脉粥样硬化大鼠的一氧化氮（Nitric oxide，NO）和前列环素（Prostaglandin I2，PGI2）水平，并降低内皮素（Endothelin，ET）水平，能减少血栓素B2（thromboxane B2，TXB2）水平但无统计学差异[9]。由于NO和PGI2可抑制血小板聚集，而ET和TXA2（TXA2半衰期很短，其含量用下游产物TXB2表示）促进血小板聚集，XML对这些因子的作用均有利于其抑制AA诱导的血小板聚集。另外，在ADP诱导血小板聚集途径中，ADP激活血小板表面ADP受体后，使细胞内cAMP降低并促进细胞内Ca2+增加，启动血小板聚集[10]。目前未见XML对ADP和cAMP作用的报道，而有研究表明XML能增加心衰心肌细胞的Ca2+内流[14]。尽管XML对血小板的细胞内Ca2+作用可能不同于对心肌細胞的作用，这种XML对Ca2+作用也可能与XML对ADP诱导血小板聚集作用较弱有关。实验也考察了XML对正常血小板的作用，发现所有浓度的XML均不会诱导血小板聚集。

目前，XML在临床的主要适应症为心功能C期与D期、纽约心脏病分级Ⅱ-Ⅳ级的心衰患者，可单独使用，也可以合用洋地黄、血管紧张素转化酶抑制剂、利尿剂、β-受体阻滞剂等。另外，XML对心脑血管缺血性疾病显示出一定的疗效，如急性心肌梗死[15]和急性脑梗死合并心力衰竭[5]。对这些缺血性疾病的治疗过程中，在使用常规的抗血小板药、抗凝药和调脂药的基础上使用XML后发现能缩小梗死范围[15]，减轻神经功能缺损[5]，除了XML具有对抗动脉粥样硬化[9]、抑制过度自由基氧化[16]、抗心律失常[17]、促进神经干细胞增殖[18]，并分化为神经元的作用外，本实验结果也表明XML对异常活化的血小板功能也有作用，其本身能直接抑制血小板聚集，改善血液流变学。实验提示在合用抗血小板药物时，XML更适合合用抑制ADP途径的药物（如氯吡格雷）优于合用抑制AA途径的药物（如阿司匹林），这是因为药物联合使用通常考虑合用不同机制的药物，而XML主要抑制AA诱导的血小板聚集，未见血栓倾向的心脑血管疾病使用XML也不会影响正常的血小板功能。综上所述，实验为XML治疗缺血性心脑血管疾病提供了可能的一种机制。

参考文献

[1]XU Z， XU YJ， HAO YN， et al. A novel STAT3 inhibitor negatively modulates platelet activation and aggregation [J]. Acta Pharmacol Sin， 2017， 38（5）： 651-659.

[2] Son E， Kim SH， YANG WK， et al. Antiplatelet mechanism of an herbal mixture prepared from the extracts of Phyllostachys pubescens leaves and Prunus mume fruits [J]. BMC Complement Altern Med，2017， 17（1）： 541.

[3] 中国中西医结合学会心血管病专业委员会心力衰竭学组，国家中医药管理局中医心血管病重点专科协作组. 规范应用心脉隆注射液治疗慢性心力衰竭的专家共识 [J]. 中国中西医结合杂志，2016，36（3）：280-284.

[4] 李会仙，谢文菠，张延婷，等. 心脉隆注射液对大鼠局灶性脑缺血的保护作用 [J]. 中药新药与临床药理，2016，27（7）：524-528.

[5] 赵晓蕾，杨春光，杨柳. 心脉隆注射液治疗急性脑便死合并慢性心力衰竭的疗效观察 [J]. 中西医结合心脑血管病杂志，2017，15（15）：1862-1864.

[6] 肖芬，吴建新. 心脉隆胶囊对原代大鼠血管平滑肌细胞形态损伤的保护作用 [J]. 大理学院学报（医学版），2012，11（9）：29-31.

[7] 张丽娜，钟荣梅，吴星恒. 心脉隆对缺氧缺血性脑损伤模型新生大鼠心肌细胞凋亡的影响 [J]. 南昌大学学报（医学版），2010，50（4）：22-26.

[8] 孙琳，张文静. 心脉隆注射液对动脉粥样硬化大鼠血脂水平的影响 [J]. 河北北方学院学报（自然科学版），2012，28（1）：67-69.

[9] 张文静，王琳琳，宋树英. 心脉隆注射液对动脉粥样硬化大鼠血管内皮细胞的保护作用 [J]. 河北北方学院学报（自然科学版），2012，28（2）：79-81.

[10]Bijak M， Sut A， Kosiorek A， et al. Dual anticoagulant/antiplatelet activity of polyphenolic grape seeds extract [J]. Nutrients， 2019， 11（1）： 93.

[11] Irfan M， Kwon TH， Yun BS， et al. Eisenia bicyclis （brown alga） modulates platelet function and inhibits thrombus formation via impaired P2Y12 receptor signaling pathway [J]. Phytomedicine， 2018（40）： 79-87.

[12] ZHOU J， SONG Z， HAN M， et al. Evaluation of the antithrombotic activity of zhi-xiong capsules， a traditional chinese medicinal formula， via the pathway of anti-coagulation， anti-platelet activation and anti-fibrinolysis [J]. Biomed Pharmacother， 2018（97）： 1622-1631.

[13] FAN H， LI M， YU L， et al. Effects of danhong injection on platelet aggregation in hyperlipidemia rats [J]. J Ethnopharmacol， 2018（212）： 67-73.

[14] 彭芳，方春生，劉晓波，等. 心脉龙注射液对家兔离体血管平滑肌的影响 [J]. 大理医学院学报，2001，10（2）：3-4.

[15] 肖军，唐发宽，王洪叶，等. 心脉隆注射液对急性心肌梗死范围的影响及其临床意义 [J]. 世界中西医结合杂志，2011，6（1）：31-32.

[16] 彭芳，刘晓波，方春生，等. 心脉隆注射液对大鼠缺氧-复氧心肌细胞内游离钙离子及脂质过氧化物的影响 [J]. 中国药业，2003，12（1）：33-35.

[17] 吴建新，钮荣祥，黄毅龙，等. 心脉隆注射液对家兔实验性心律失常的防治作用 [J]. 大理学院学报（医学版），2002，11（2）：18-20.

[18] 满潇潇，于君，王晓云，等. 心脉隆注射液对新生SD大鼠海马神经干细胞增殖分化的影响 [J]. 山东大学学报（医学版），2012，50（6）：46-50.

（收稿日期：2019-08-22 编辑：程鹏飞）