耐力训练减轻高脂饮食相关非酒精脂肪肝大鼠肝脏炎症的内质网机制研究

打开文本图片集

摘 要：目的：内质网稳态紊乱是炎症发生的关键机制;运动抗炎作用已取得广泛共识，然而运动改善非酒精性脂肪肝（NAFLD）炎症反应的内质网机制尚不清楚。通过高脂饮食（HFD）建立肥胖相关的NALFD模型，以跑台耐力训练为干预手段，监测HFD引起的肝脏炎症事件，并探讨运动抗炎的内质网机制。方法：Sprague-Dawley雄性大鼠80只，随机分成正常饮食组（CON）、正常饮食运动组（CON + AET）、高脂饮食组（HFD）和高脂饮食运动组（HFD + AET）。8周训练结束后采用O油红染色法观察肝脏形态学改变;ELISA法测定肝脏炎症标志物蛋白浓度;Western blot测定内质网稳态标志蛋白及相关炎症调控信号通路。结果：8周高脂饮食后，与对照组相比，模型动物肝细胞脂滴数量显著性增加;炎症趋化因子（IL-6，IL-18，IL-1β和TNF-ɑ）浓度均显著性升高;炎症转录调节因子NF-κB和AP1表达上调，炎症通路ATF6，IRE1α-XBP1/IKK，PERK和IRE1α-eIF2α/JNK被激活;内质网稳态蛋白GRP78和CHOP表达明显增加。相对地，运动干预可明显减少肝脏组织脂滴数量，降低IL-18、IL-1β和TNF-ɑ浓度，失活炎症通路蛋白及炎症转录因子水平，下调GRP78、CHOP蛋白表达。结论：高脂饮食可引起大鼠肝脏内质网稳态紊乱，激活炎症相关信号通路，触发炎症反应;运动干预可有效改善HFD后炎症事件;其中维持内质网稳态及失活相关炎症调节信号级联是其内在关键机制。

关键词：高脂饮食;炎症;内质网稳态/应激;耐力训练

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）已跃居慢性肝病首位，且发病“时间窗”呈现前移/年轻化趋势，严重威胁着肥胖相关群体的健康[1]。NAFLD通常被认为是代谢综合征的肝脏组成部分，是由营养素过度摄入引起的“代谢性炎症”[2]。炎症相关因子在肥胖相关胰岛素抵抗的发展中起着核心作用，并与NASH进展直接相关[3]。因此，减轻炎症反应是NAFLD治疗的一个新方向。

缺血、钙离子紊乱、氧化应激、肥胖等因素引起的内质网稳态紊乱是（轻度持续性慢性）炎症发生的重要病理机制[4]。研究显示化學分子伴侣，如4-苯基丁酸钠盐、牛磺熊去氧胆酸通过抑制内质网应激，改善高脂饮食小鼠肝脏脂代谢紊乱及炎症水平[5]。因此，维持内质网稳态是实现NAFLD“细胞器”治疗的重要思路。

作为一种广谱“抗炎剂”，运动以多靶点、多途径、疗效确切、无副作用等特点日益受到关注和推崇。研究证实运动可以有效改善脂肪酸转运和利用[7]，抑制线粒体相关的炎症信号通路[6]等。运动对NAFLD内质网影响的研究主要集中在抑制肝脏细胞凋亡[8]，改善自噬[9]方面，而其对内质网介导的炎症事件的改善作用/机制则鲜有报道。

为研究运动对NAFLD的肝脏组织炎症病理进程的影响，本研究基于高脂饮食诱导建立肥胖相关的NAFLD大鼠模型，分别给予实验对象以高脂和标准饮食，同时进行跑台耐力训练干预。检测不同分组动物肝脏组织病理变化，炎症标志分子，内质网相关炎症信号通路的改变，初步探索运动抗炎的内质网机制。为NAFLD在亚细胞水平的治疗提供新思路，为其临床运动防治提供应用理论和实践依据。

1 材料和方法

1.1 实验试剂

抗核转录因子激活蛋白-1（AP1），核转录因子kappa B（NF-κB），X盒结合蛋白（XBP）1，c-Jun氨基末端激酶（JNK）;磷酸化JNK;核因子κ-B激酶抑制剂（IKK）及磷酸化IKK购自于Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz，CA，USA）;抗真核起始因子（eIF）2α，磷酸化p-IF2α，葡萄糖调节蛋白（GRP）78，C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白（CHOP）;甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），羊抗兔和羊抗小鼠IgG（辣根过氧化物酶标记）二抗由Cell Signaling Technology（Danvers，MA，USA）提供。ELISA试剂盒（卡尔文生物，苏州）;PVDF膜，ECL发光液体（Millipore，MA，USA）;BCA蛋白定量试剂盒，显影及定影液（Beyotime，北京）。其余常用实验药品或试剂均由当地零售供应商。

1.2 实验动物及NAFLD模型建立

Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠80只购自于复旦大学实验动物中心，许可证号：SYXK沪2014-0029。8周龄，体重185 ～ 210 g;饲养环境：温度：22℃～26℃;湿度：60%，分笼饲养（笼/8只）;昼夜光变化周期：12 h光照，12 h黑暗;适应喂养期动物自由饮食。之后随机调整动物饲养方案，动物数量比为1 ∶ 1。具体饲养组分方案[10]参照见表1。

1.3 动物分组及运动干预

正常饮食方案大鼠分为对照组（CON）和正常饮食运动干预组（CON + AET）;高脂饮食方案动物分为高脂模型组（HFD）和高脂饮食运动干预组（HFD + AET）。每组20只。CON + AET和HFD + AET组进行8周跑台训练。耐力训练方案参照我们之前的研究方法[11]。简要如下：大鼠先进行为期1周的适应性训练（15 m/min;6 d/w）进行动物运动能力评估，剔除不善运动的动物，之后进行正式实验。运动方案为：每周训练为6 d，跑台训练时间为1 h，速度为20～25 m/min;训练时间在每天08：00～10：00，坡度为5°。终末做力竭运动进行大鼠运动能力测试。

1.4 动物处死及取材

8周干预结束后，实验动物禁食过夜，次日上午8：00麻醉（2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉）颈椎脱臼法处死，采集肝脏组织并置于液氮冻藏待测。模型构建评价由专科医生通过组织病理学切片进行盲法判定。