胃癌组织中Livin蛋白的表达及其与临床生物学行为及细胞增殖的关系

[摘要] 目的 探讨胃癌组织中Livin蛋白的表达及其与临床生物学行为及细胞增殖的关系。 方法 免疫组化检测70例胃癌及癌旁正常组织中Livin蛋白的表达，并探讨其与性别、年龄、组织分化度、浸润深度和淋巴结转移等临床生物学行为和细胞增殖的关系。 结果 胃癌标本中Livin的阳性率明显高于癌旁正常组织（χ2=18.53，P < 0.01）。高-中分化胃癌Livin阳性率明显低于低-未分化，T1～2期胃癌Livin阳性率明显低于T3～4期，无淋巴结转移胃癌Livin阳性率明显低于有淋巴结转移（P均< 0.05）。Livin表达阴性的胃癌组织中PCNA增殖指数明显低于Livin表达阳性（P < 0.05）。 结论 Livin基因参与胃癌的发病过程，与胃癌细胞的异常增殖和恶性转化密切相关，Livin基因不仅参与癌细胞凋亡的调控，还促进了癌细胞的异常增殖。

[关键词] 胃癌；Livin；临床生物学行为；细胞增殖

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）04-0051-02

近年来研究认为肿瘤的发病过程多步骤、多阶段、有序的病理过程，不仅与癌细胞异常分化密切相关，而且与癌细胞凋亡受抑制相关。凋亡通路的调节紊乱及凋亡相关基因及蛋白的表达异常，均可导致肿瘤的发生和发展。近年来凋亡抑制蛋白（IAP）家族在恶性肿瘤中的作用逐渐引起人们重视。Livin是IAP家族一种新成员，常在人胚胎组织和大多数实体肿瘤中特异性表达，而在正常人体组织中表达较少、甚至不表达，对抑制癌细胞的凋亡起着重要作用。近年来研究发现其异常表达与肿瘤的发生、发展、转移和预后等病理特征密切相关，但有关胃癌组织中Livin基因的表达及其与生物学行为的关系国内外报道较少[1，2]。本研究观察了胃癌组织中Livin蛋白的表达及其与临床生物学行为及细胞增殖的关系，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集2007年8月～2012年7月两院有完整临床及病理学资料的胃癌及癌旁正常组织存档蜡块70例，常规予以组织固定、脱水、透明、包埋及切片。其中男48例，女22例，年龄39～87岁，平均（64.2±7.1）岁。术前均未行化放疗和免疫治疗。

1.2 免疫组化染色

采用常规Envision二步法测定Livin和PCNA的表达。常规4 μm石蜡切片，逐级脱蜡到水，3%双氧水室温下常规孵育10 min，微波进行抗原修复，滴加血清封闭15 min，倾去血清分别滴加Livin或PCNA一抗常规4℃过夜，后滴加二抗37°C孵育30 min，常规予以显色、复染、脱水、透明、封片及镜检。用已知阳性切片行阳性对照，以PBS溶液代替一抗工作液行阴性对照。兔抗人Livin蛋白多克隆抗体、鼠抗人PCNA单克隆抗体和免疫组化Envision二步法试剂盒均由北京中杉金桥生物公司提供，严格按照试剂盒所附说明书进行实验。

1.3 结果判定

1.3.1 Livin染色判断[3] 以胞浆出现棕黄（褐）色颗粒为阳性细胞。按高倍镜下细胞染色强度无着色、浅黄色、棕黄色和棕褐色分别计为0～3分；另选5个随机高倍视野，根据阳性细胞的比例分别计为0～4分，其中（-）计0分、≤10%计1分、11%～50%计2分、51%～75%计3分、>75%计4分。根据细胞染色强度和阳性细胞比例计分的乘积≥2分即认为Livin（+）。

1.3.2 增殖指数（PI） 采用高清晰度彩色图文分析系统，选择10个高倍视野，观察1 000个肿瘤细胞中PCNA染色的阳性细胞百分比，即为增殖指数（PI）。

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0统计学软件分析。计数资料结果以率表示，采用χ2检验。

2 结果

2.1 胃癌及癌旁正常组织中Livin表达的差异

70例胃癌组织标本中的Livin表达阳性36例，其中强阳性为14例。70例癌旁正常组织中4例Livin表达弱阳性。胃癌标本中Livin表达的阳性率明显高于癌旁正常组织（χ2=18.53，P < 0.01）。见图1。

2.2 胃癌组织中Livin表达与临床生物学行为的关系

胃癌组织中Livin表达与性别和年龄无明显的统计学关系（P > 0.05）。高-中分化胃癌Livin阳性率明显低于低-未分化，T1～2期胃癌Livin阳性率明显低于T3～4期，无淋巴结转移胃癌Livin阳性率明显低于有淋巴结转移，差异均有统计学意义（P均< 0.05）。见表1。

2.3 胃癌组织中Livin表达与细胞增殖的关系

Livin表达阴性和阳性的胃癌组织中PCNA增殖指数分别为（37.24±13.25）%和（57.27±18.75）%。Livin表达阴性胃癌组织中PCNA增殖指数明显低于Livin表达阳性（t =2.38，P < 0.05）。

3 讨论

胃癌的发生及发展过程是一个多基因、多阶段和多步骤逐步推进的综合性病理过程，其中抑癌基因在其发病中作用特别重要。Livin基因是一种临床新发现的抑癌基因，位于20号染色体q13，因转录产物剪接方式不同分别形成1 351 bp和1 297 bp两种mRNA亚型，分别编码298个氨基酸和280个氨基酸的Livin-α和Livin-β[5，6]。Livin基因常以丝状形式存在，含有一个BIR结构功能区和锌指样结构，其抗凋亡活性主要依赖于BIR结构功能区。前者具有结合和抑制Caspase活性的部位[4]。目前研究认为Livin基因的BIR结构功能区能与Caspase结合，抑制Caspase的活性，特别是Caspase-3、9的活性而抑制癌细胞的凋亡而发挥作用；还可通过激活TAK1/JNK1信号传导途径抑制癌细胞的凋亡[7，8]。

Livin抑癌基因与胃癌的发病过程及生物学行为关系密切。应荣彪等[9]研究发现Livin在胃癌中呈特异性的表达明显高于癌旁组织和正常胃组织，Livin的激活与胃癌的发病过程密切相关，可判断胃癌的恶性程度、浸润深度和预后，是胃癌诊断、预后评估和免疫治疗的一个新的作用靶点。赵毅等[10]研究显示胃癌标本中Livin蛋白的表达程度与其分化程度呈负相关，与浸润深度、淋巴结转移及临床TNM分期呈正相关，可见Livin的高表达可促进胃癌的浸润和转移，是胃癌预后不良的指标。本研究结果显示胃癌组织中Livin的阳性率明显高于癌旁正常组织，提示Livin基因与胃癌细胞的异常增殖和恶性转化密切相关，参与胃癌的发生及发展过程。同时研究还发现高-中分化胃癌Livin阳性率明显低于低-未分化，T1～2期胃癌Livin阳性率明显低于T3～4期，无淋巴结转移胃癌Livin阳性率明显低于有淋巴结转移。提示胃癌中Livin表达与癌组织的分化程度呈负相关，与浸润深度和淋巴转移呈正相关，推测Livin的持续表达可进一步参与胃癌的恶性演进过程，且胃癌恶性程度和预后密切相关。我们推测Livin基因可能通过抑制Caspase-3、9的活性阻断凋亡受体通路以及通过调控凋亡线粒体的通路而抑制胃癌细胞凋亡作用[11]。崔钊等[12]研究认为胃癌组织中Livin蛋白的表达与Ki67蛋白的表达具有明显的正相关，表明Livin蛋白不但参与胃癌的发生和发展过程，而且与胃癌细胞的凋亡与增殖的病理过程密切相关。本研究结果还发现Livin在胃癌中的表达与PCNA的增殖指数呈正相关，表明Livin基因不仅参与癌细胞凋亡的调控，还促进了癌细胞的异常增殖。

总之，Livin基因参与胃癌的发病过程，其表达与胃癌的分化程度、浸润深度和淋巴结转移等临床生物学行为具有明显相关性，与胃癌细胞的异常增殖和恶性转化密切相关，Livin基因不仅参与癌细胞凋亡的调控，还促进了癌细胞的异常增殖，有望成为胃癌基因诊断与治疗的理想靶点[13，14]。

[参考文献]

[1] Hariu H，Hirohashi Y，Toshihiko T，et al. Aberrant expression and potency as a cancer immunotherapy target of inhibitor of apoptosis protein family， Livin/ML IAP in lung cancer[J]. Clin Cancer Res，2005，11（3）：1000-1009.

[2] Kasof GM，Gomes BC. Livin， a novel inhibitor of apoptosis protein family member[J]. J Biol Chem，2001，276（5）：3238-3246.

[3] 谢文君，李晓虹，付天红. Livin蛋白在膀胱移行细胞癌组织芯片中的表达及临床意义[J]. 中国现代医生，2011，49（31）：88-89.

[4] Abd-E lrahman I，Hershko K，Neuman T，et al. The inhibitor of apoptosis prote in Livin （ML-IAP） plays a dual role in tumor igenicity[J]. Cancer Res，2009，69（13）：5475-5480.

[5] Wagener N，Crnkovic-Mertens I，Vetter C，et al. Expression of inhibitor of apoptosis protein Livin in renal cell carcinoma and non-tumorous adult kidney[J]. Br J Cancer，2007，97（9）：1271-1276.

[6] 何煎太，李珍发，张阳德，等. 凋亡抑制因子Livin在大肠癌中的表达意义[J]. 中国现代医学杂志，2007，17（6）：654-657.

[7] Jiang L，Li X，Bai L，et al. Expression of livin at the invasive tumor front of oral squamous cell carcinoma[J]. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2010，30（6）：1398-1400.

[8] Gao JM，Wang X，Liu XQ，et al. Clinical significance of Livin expression in non-Hodgkin" s lymphoma[J]. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi，2010，18（2）：385-390.

[9] 应荣彪，冯俊，李建军，等. 凋亡抑制因子在胃癌中的表达及其临床意义[J]. 肿瘤学杂志，2010，16（3）：217-219.

[10] 赵毅，邓鑫，王强. Livin Smac/DIABLO和PTEN在胃癌组织中的表达及其与胃癌的相关性[J]. 世界华人消化杂志，2009，17（13）：1303-1311.

[11] 陈鹏，王春松，孔令斌. 凋亡抑制蛋白Livin与胃癌的研究进展[J]. 实用医学杂志，2008，24（23）：3991-3992.

[12] 崔钊，赵毅，邓鑫，等. 凋亡抑制蛋白Livin和Ki67在胃癌的表达及临床意义[J]. 生物医学工程与临床，2009，13（2）：146-148.

[13] 张健，王雪松，李洪运，等. 凋亡抑制基因Livin在人胃癌组织中的表达及临床意义[J]. 实用肿瘤杂志，2010，25（5）：546-549.

[14] Brandacher G，Perathoner A，Ladurner R，et al. Prognostic value of indoleamine 2， 3-dioxygenase expression in colorectal cancer： effect on tumor- infiltrating T cells[J]. Clin Cancer Res，2006，12（4）：1144-1151.

（收稿日期：2012-11-29）