应用PCR技术快速检测口腔念珠菌菌株

[摘要]目的：本研究将PCR技术应用于口腔念珠菌检测中，寻找出一种能够快速、准确、有效检测口腔念珠菌的方法。方法：收集口腔临床唾液样本100例，科玛嘉显色培养基进行培养，同时应用PCR方法对100例临床样本进行检测鉴定。结果：传统念珠菌培养方法的检出率为35%；应用两对引物，PCR方法的检出率分别为68%和49%。传统的念珠菌检测方法耗时长，特别是培养法，需时48hrs；应用PCR方法对念珠菌进行检测，只需要5hrs，且阳性检出率和准确性较高。结论：PCR方法快速敏感、特异性高，相较于念珠菌传统培养方法，是一种更加简便理想的检测方法。

[关键词]口腔念珠菌；培养；聚合酶链反应

[中图分类号]R783 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2011）09-01439-03

Application of PCR in rapid detection of oral candida

DENG Ni1,CHE Tuan-jie2,LEI Ke3,LIAO Tian-an1,HE Xiang-yi3

(1.Department of Stomatology，Hainan Provincial People"s Hospital，Haikou 570311,Hainan,China;2.School of Life Science,Lanzhou University;3.School of Stomatology,Lanzhou University)

Abstract:ObjectiveThis study was performed to through PCR technology to find a rapid, accurate and effective detection that is used to detect oral candida. Methods Collecting 100 specimens of saliva, then culture these on CHROMagar media and detect by PCR. Results The positive rate of oral candida is 35% by traditional cultural detection while by PCR technology in two primers are 68% and 49% respectively. The traditional detections for candida are time-consuming,especially in culture method which consumes 48hrs at least;to apply PCR method to detect candidas only need 5hrs with high positive rate and accuracy. ConclusionTo compare with traditional culture method for Candidas,PCR technology is more perfect and handy.

Key words:candida;culture;PCR

随着各种侵入性诊断治疗手段如手术干预、化疗、放疗或联合治疗等的广泛开展，以及各类免疫抑制制剂和广谱、超广谱抗生素的大量使用，自身免疫低下患者临床上念珠菌感染的发病率明显增高，已成为影响患者健康及威胁患者生命的重要原因。同时，念珠菌感染与很多口腔疾病相关，如口腔念珠菌病，口腔扁平苔藓，口腔白斑等。其中，白色念珠菌作为口腔粘膜多种感染的致病因子的作用及其在白斑向癌转变过程中的促进作用均已得到肯定[1]。因此，快速准确地检测口腔念珠菌，对研究念珠菌对口腔的致病性和预防、监测口腔念珠菌感染都具有十分重要的意义。随着分子生物学技术的飞速发展，聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)逐渐应用于临床病原菌的检测和鉴定。PCR方法快速敏感、特异性高，不仅能检测出活力较高的致病菌，而且能检测出活力较低而难以培养的真菌，为临床检测念珠菌提供了更有效的途径。本研究将PCR技术应用于检测口腔念珠菌中，寻找出一种能够快速、准确、有效检测口腔念珠菌的方法。

1材料和方法

1.1 菌种和试剂

1.1.1菌种：于兰州大学口腔医院采集100 例口腔唾液样本。

1.1.2试剂和仪器：试剂： TE-TritonX-100裂解液， PCR试剂 (Taq酶、10×buffer、dNTP混合物、引物)，科玛嘉念珠菌显色培养基（科玛嘉公司，法国）。主要仪器：PCR仪（MG-96+杭州朗基科学仪器有限公司），电泳仪（DYY－8c型，北京市六一仪器厂），电子恒温培养箱（DNP-9162上海精宏）。

1.1.3引物选取：选择检测念珠菌常用的真菌通用引物①，以及一组念珠菌特异性引物②。

①：ITS4 5"TCCTCCGCTTATTGATATGC 3"

ITS86 GTGAATCATCGAATCTTTGAAC

②：ITS1 5"TCC GTA GGT GAA CCT GCG G3"

ITS4 5"TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3"

Ca15"GGT TTG CTT GAA AGA CGG TAG3"

Ca25"AGT TTG AAG ATA TAC GTG GTA G3"

Ct15"CAA TCC TAC CGC CAG AGG TTA T 3"

Ct25"TGG CCA CTA GCA AAA TAA GCG T3"

1.2 实验方法

1.2.1 念珠菌菌株的培养、分离和鉴定：将100例临床唾液样本接种于科玛嘉念珠菌显色培养基(37℃,48h)进行培养，阳性样本中挑取其中15例的单菌落移种于科玛嘉培养基平板进行培养(37℃,48h)，在科玛嘉培养基上传代3次，以分离、纯化。科玛嘉培养基对照结果：白色念珠菌（绿色），热带念珠菌（蓝灰色），光滑念珠菌（紫色），克柔丝念珠菌（粉色）。

1.2.2 菌体培养：挑取科玛嘉显色培养平板纯培养的单菌落接种于3ml沙堡弱培养液，37℃振荡培养48h。

1.2.3 DNA提取：将念珠菌液离心(10 000r/m,10min)，弃上清液，每份样本加1ml裂解液（0.2mol/L Tris-HCl，1% SDS，0.25mol/L NaCl，0.025mol/L EDTA PH8.0），55℃ 1h，100℃煮沸15min，加3mol/L NaAc 50μl，-20℃放置20min，解冻后离心（10 000r/m，15min），取上清液加等体积的酚氯仿，充分混匀后离心（4℃，10 000r/m，10min），取上清液加2倍体积无水乙醇，-20℃放置20min，离心（4℃，10 000r/m，10min），弃上清液，70%乙醇洗管壁，枪尖吸干残留乙醇，置超净台吹干，管底见透明胶状DNA。加入200μl TE溶解沉淀。

1.2.4 DNA标化：将提取的15株念珠菌的DNA分别进行OD260和OD280检测，所得OD260/280值都在1.5～2.0。将每种念珠菌的DNA标化为DNA含量为100ng/μl，作为模板。

1.2.5 基因扩增：分别以预先提取的念珠菌基因组DNA为模板进行PCR反应。反应条件为：模板10μl，引物1μl，10×buffer(Mg2+Free)5μl，dNTP 1μl，Taq酶(5U/μl)1μl，DMSO 0.5μl，补足ddH2O至终体积为50μl。反应程序为94℃ 3min 预变性；94℃ 15s 变性，55℃ 15s 退火，72℃ 30s 延伸，30个循环；72℃5min。

1.2.6 PCR产物检测：PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后用凝胶成像系统分析。

1.2.7 测序验证：挑选相同的样本，用扩增出的单片段进行测序，测定的序列通过BLAST程序与数据库中进行比对，根据同源性比对结果，确定序列来源，用来验证改良多重PCR检测口腔念珠菌菌种的准确性。

1.2.8 统计学分析：应用SPSS 13.0统计软件进行分析，数据采用卡方检验进行统计。

2结果

2.1 培养结果如图1。

2.2基因组DNA 提取：提取的念珠菌DNA均呈无色透明状，经检测所得DNA的OD值都在1.5～2.0，表明蛋白质等杂质去除较干净，DNA纯度较高，电泳结果条带清晰、干净，无拖尾现象，说明模板的完整性好，符合分子标记所需的高质量的模板要求。

2.3不同引物对模板产物的凝胶电泳检测

2.3.1真菌通用引物②ITS4、ITS86进行扩增，扩增片断的长度均在250bp左右（如图2）。

2.3.2 念珠菌特异性引物③ITS1，ITS4；Ca1，Ca2；Ct1，Ct2进行扩增。扩增片段长度：白色念珠菌为550bp和150bp两条带，热带念珠菌为350bp，克柔念珠菌为550bp，光滑念珠菌为900bp（如图3）。

2.4培养法与PCR法结果比较

2.5 PCR检测结果的测序验证

2.5.1测序验证：挑选光滑念珠菌样本，用扩增出的单片段进行测序，测定的序列通过BLAST程序与数据库中进行比对,根据同源性比对结果，光滑念珠菌的相似率为99%（如图4）。

3讨论

念珠菌是一类条件性致病真菌，广泛定殖于人类的各种腔道内，是最常见的深部真菌感染的病原菌。正常情况下,念珠菌和宿主之间保持着平衡，在健康人群阴道、口腔、肠道中可作为良性寄生菌与宿主共存，通常并不致病。但当宿主机体免疫功能下降时，这种平衡会被破坏，这些条件致病菌可作为念珠菌性阴道炎、口腔炎、甚至胃肠炎等深部念珠菌感染的致病因素[2]。通常，念珠菌可粘附于口腔的任何部位，念珠菌感染可引起很多口腔疾病，如口腔念珠菌病、口腔白斑、义齿性口炎、鹅口疮等。念珠菌病也发生于食道中，引起疼痛和吞咽困难[3]。近年来，随着各种侵入性诊断治疗手段如手术干预、化疗、放疗或联合治疗等的广泛开展，以及各类免疫抑制剂和广谱、超广谱抗生素的大量使用，自身免疫低下患者临床上念珠菌感染的发病率明显增高[4-5]。如何快速准确地检测念珠菌成为临床医师面临的一个重要问题。

目前，在临床上，培养是检测念珠菌的主要方法，但培养存在着耗时长，阳性率低的缺点，加之在感染早期侵袭的病原菌较少，对临床诊断念珠菌感染有较大的影响。本实验应用科玛嘉念珠菌显色培养基进行培养鉴定，培养时间为48hrs，100例口腔临床样本培养出念珠菌35株，阳性率为35%，培养时间长且阳性率较低，不能满足临床检测的要求。

随着现代分子生物学技术的不断发展，应用分子生物学手段对念珠菌进行检测成为可能，而且已成为研究的主要方向。传统的检测方法需要对样品进行分离培养，往往要花上几天乃至数周的时间，而且有些致病菌难以人工培养，给检测带来困难,而聚合酶链反应（PCR）技术的应用，克服了上述不足。与传统生物检测方法相比，PCR方法不仅检测时间短、灵敏度高，还可以检测出一些培养法不能检测的微生物种类[6]。本实验中应用引物①和②对100例样本进行PCR检测的结果分别为68株和49株，阳性率分别为68%和49%，同科玛嘉培养法的检出率35%相比，差异具有显著统计学意义(P＜0.05)。同时，应用念珠菌特异性引物②还可分辨出不同的念珠菌，热带念珠菌，单一条带,大小约350bp；白色念珠菌，2条带，150bp和550bp；光滑念珠菌，单一条带，大小约900bp；克柔念珠菌,单一条带，大小约550bp[7]。通过测序验证，证明应用PCR检测念珠菌菌株的准确性高。同传统的培养方法相比较，PCR具有特异性强、敏感性高、产率高、快速、简便、重复性好，易自动化等特点。PCR 基因鉴定结果与临床培养结果一致，直接PCR 法从取样到获得凝胶电泳结果，耗时约5h，与一般临床念珠菌培养检测3～5天相比，快速、省时，有助于临床对真菌感染的早期快速诊断，且PCR方法操作简单易于掌握，有望成为临床常规使用的念珠菌诊断方法。

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[收稿日期]2011-03-10[修回日期]2011-04-25

编辑/何志斌