色素上皮衍生因子对小鼠肾透明细胞癌模型的抑制研究

[摘要] 目的 研究重组人色素上皮衍生因子（rPEDF）在体内抑制肾透明细胞癌组织血管生成从而抑制肿瘤生长。方法 肾透明细胞癌细胞株786-0以浓度为5×106/100 μL在裸鼠左腋部背侧皮下注射，建立皮下移植瘤模型，分为两组（每组6只）：对照组（药物用PBS代替），1 μg/200 μL rPEDF治疗组，每日1次，连续注射2周。测量肿瘤大小，肿瘤组织行HE染色和免疫组织化学方法检测CD34标记的微血管。 结果 PBS对照组与rPEDF治疗组移植瘤平均体积分别为（1672.23±65.28）mm3和（1202.44±56.34）mm3，抑瘤率为28%，两组比较差异有显著性（P = 0.034）。PBS对照组与rPEDF治疗组小鼠移植肾透明细胞癌组织中微血管密度（MVD）平均为（72.83±12.34）和（25.67±8.56）/高倍镜视野，治疗组小鼠移植肾透明细胞癌组织中MVD减少65%，两组比较差异具有显著性（P = 0.006）。 结论 rPEDF治疗组小鼠移植瘤微血管密度明显减低，移植瘤的体积也相应减低，提示rPEDF能抑制血管新生，减缓肾透明细胞癌生长。

[关键词] 肾癌；裸鼠；色素上皮衍生因子；血管生成

[中图分类号] R737 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）23-0010-02

肿瘤的生长依赖肿瘤血管的生成，抑制肿瘤血管的生成，能切断肿瘤生长的营养供应途径，阻断肿瘤血运侵袭转移途径，从而有效遏制肿瘤的生长转移，是治疗肿瘤的有效方法。PEDF能抑制血管内皮细胞的增殖和迁移，抑制血管管状形成；体内移植瘤模型实验结果表明，PEDF有效抑制新生血管的形成，并能抑制肿瘤的生长和转移。在前期研究工作中，我们发现肾透明细胞癌组织PEDF的表达与肿瘤微血管密度成反比[1]，是否应用重组人色素上皮衍生因子（rPEDF）在体内抑制肾透明细胞癌组织血管生成，导致肿瘤萎缩？在前期的研究结果基础之上，我们采用皮下接种的方法建立裸鼠的肾透明细胞癌模型，经过rPEDF的治疗，测定两种方法的抑瘤率，采用免疫组化方法检测肾透明细胞癌模型微血管密度的变化，从而判定rPEDF对肾透明细胞癌血管生成及肿瘤生长的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料及分组处理

1.2 肿瘤微血管密度计数

MVD 检测方法按Weidner[2]等法，CD34定位于血管内皮细胞胞浆，呈棕黄色。先在低倍镜（4×10）下观察整个切片，选取血管内皮细胞染色清晰，背景对比良好、微血管数量最密集的视野，再在高倍镜（20×10）下观察每单位面积（0.723 mm2）组织内CD34单克隆抗体标记的微血管（MV）数。结果以5个高倍（20×10）视野MV数的均数表示。

1.3 统计学方法

采用SPSS15.0软件进行分析，肿瘤体积和微血管密度均为连续计量资料，采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组裸鼠肿瘤体积情况

所有裸鼠移植瘤的发生率为100%，两组小鼠移植瘤均经HE染色确认为透明细胞癌，在整个实验过程中无裸鼠死亡，经注射rPEDF和PBS后，完成两周治疗后第4天，PBS对照组与rPEDF治疗组移植瘤平均体积分别为（1 672.23± 65.28）mm3和（1 202.44±56.34）mm3，两组比较差异有统计学意义（t = 2.467，P = 0.034），抑瘤率为28%。

2.2 免疫组化检测肿瘤微血管密度

两组小鼠移植瘤组织中均可见CD34标记的微血管，提示移植瘤组织中有大量新生血管的存在，微血管呈网状、管状散在或弥漫分布，血管形态差异性较大。PBS对照组与rPEDF治疗组小鼠移植瘤组织中MVD平均分别为（72.83±12.34）和（25.67±8.56）/高倍镜视野，两组比较差异具有显著性（t = 3.421，P = 0.006），rPEDF治疗组小鼠移植肾透明细胞癌组织中MVD减少65%。

3 讨论

外科手术是治疗肾透明细胞癌唯一有效的方法，但仅局限早期肾癌，有30%的患者可出现复发或转移，因肾透明细胞癌中有多种耐药蛋白过度表达，常规化疗收效甚微，已经发生肾癌转移的患者5年生存率仍然非常低，中位生存期只有12个月。非特异性免疫治疗白细胞介素-2（IL-2） 或干扰素α或联合化疗虽被公认是第一线方案，但只有少数患者明显受益，有效率仅有15%，其他的治疗方式诸如基因治疗、激素治疗等，疗效不肯定或无效，因此，寻找肾细胞癌新的预后指标和治疗方法非常重要[3，4]。

1963年Folkman等[5]发现有效抑制肿瘤血管的生长能阻止肿瘤的生长。1971年Folkman[6]又提出了肿瘤生长和转移依赖于血管的生长，认为有效抑制肿瘤血管的新生可以治疗肿瘤，肿瘤生长需要新生的血管，当肿瘤体积超过1～2 mm3，如没有血管的新生，肿瘤细胞就会死亡，新生血管的数量关系到肿瘤生长速度。曾有鼠移植瘤的研究结果表明[7]：当无血管时，移植瘤生长缓慢，呈线性生长，而当有血管生成时，移植瘤生长迅速，呈指数生长。

大部分肾透明细胞癌患者由VHL基因突变造成HIF-1α相关基因的转录激活，使VEGF、PDGF等多数生长因子过度表达，使血管内皮细胞过度分裂增殖，使新生血管增生，造成肾透明细胞癌是一种富有血管的实体肿瘤，而且肿瘤的微血管密度与肿瘤的预后相关。对于肾透明细胞癌的生物靶向治疗就是抑制这些过度表达的血管生长因子[8，9]。使用单克隆抗体可以直接抑制过度表达的VEGF、PDGF、 EGF、TGF-α等血管生长因子，从而抑制肿瘤新生血管的形成，从而可以阻断肿瘤的生长及转移。目前这些治疗肾透明细胞癌研究取得一定的进展，在临床上也有一定的治疗效果。

1999年 Dawson[10]发现了PEDF能有效抑制血管的新生，是目前最强的内源性血管生成抑制因子，其抑制血管新生的能力是血管抑素的2倍，是内皮抑素的7倍。Abramson等[11]报道PEDF能有效抑制Wilms瘤的生长，正常肾小管上皮细胞中PEDF表达量明显高于Wilms瘤中PEDF表达，由于PEDF的低表达降低了抑制肾Wilms瘤中血管新生的能力，从而导致Wilms瘤的血管密度增加，rPEDF可抑制Wilms瘤的生长。

我们曾报道[1]，肾透明细胞癌的PEDF表达与肿瘤MVD呈负相关，PEDF表达阳性者生存时间长于PEDF表达阴性者。为了研究rPEDF对动物移植肾透明细胞癌是否有相同的作用，我们建立小鼠的肾透明细胞癌动物模型，采用rPEDF瘤内注射组及PBS瘤内注射组。我们通过CD34来标记肿瘤新生微血管，通过检测小鼠移植肾透明细胞癌的微血管密度来确定rPEDF对肾透明细胞癌血管新生是否有影响，我们的结果表明rPEDF瘤内注射组的肿瘤微血管密度明显低于PBS注射组，另外我们还发现rPEDF治疗组的肿瘤在接受2周的rPEDF移植瘤瘤内注射后，移植瘤的直径明显小于只接受PBS注射的对照组，PEDF对肾透明细胞癌新生血管的抑制可有效抑制肾透明细胞癌增殖生长。虽然接受rPEDF瘤内注射后肿瘤微血管密度下降程度大于肿瘤体积的下降程度，考虑肾透明细胞癌组织具有丰富的微血管，降低部分血管密度，肿瘤组织仍可靠周围的细胞进行营养弥散扩张，只有明显降低微血管，才能减慢肿瘤生长。

国外研究表明[12]，rPEDF选择性抑制新生血管的生长，不能抑制本身已经存在的血管，另外研究[13]表明PEDF只对血管内皮细胞有抑制作用，rPEDF不能抑制成纤维细胞及平滑肌细胞，基于PEDF能特异性抑制肿瘤血管的新生，对于肾透明细胞癌的治疗具有良好的应用前景。

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（收稿日期：2013-03-04）