以D2EHPA为流动载体的乳状液膜萃取菲牛蛭中的水蛭素实验研究

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[摘要]目的：研究以菲牛蛭为原料，二^-（2^-乙基已基）磷酸（D2EHPA）作流动载体，脱水山梨醇脂肪酸酯（Span 80）为乳化剂，辛烷与D2EHPA混合构成膜溶液，稀HCl溶液作内水相的水蛭素乳状液膜体系萃取。方法：用正交试验优化膜相、内水相体积比（MIPVR），内、外水相的pH，流动载体浓度等水蛭素对照品萃取条件，然后用水蛭素粗提液进行纯化实验。结果：萃取的最优条件为：MIPVR 10∶3，内水相pH 2.6，外水相pH 3.4，流动载体质量分数2%；当水蛭素初始浓度为1 抗凝血酶活力单位（ATU）·mL^-1时，对照品ATU回收率为83.06%，粗提液达到82.99%，样品比活力为3 289.48 ATU·mg^-1，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳及光谱扫描结果表明纯度与对照品相当。结论：乳状液膜体系萃取水蛭素工艺较简单，实验样品纯度及ATU回收率均较高。

[关键词]乳状液膜；二^-（2^-乙基已基）磷酸；水蛭素；萃取；载体

水蛭（leech）俗称蚂蝗，是一味传统的活血化瘀中药。《神农本草经》中记载“水蛭味咸平，主逐恶血、瘀血、月闭，破血瘀聚集，无子，利水道”。近代张锡纯赞扬此药“破瘀血而不伤新血，纯系水之精华生成，于气分现丝毫无损，而瘀血默消于无形，真良药也”[1]。我国古代已广泛使用水蛭治疗与血液瘀滞有关的各种疾病，在西方，人们很早就用水蛭消除淤血、脓血和毒血。现代研究发现，水蛭的主要有效成分是水蛭素。天然水蛭素是从吸血水蛭唾液腺中分离出来的酸性多肽类物质[2]，具有强烈的抗凝血酶活力且极其稳定，能耐受0.1 mol·L^-1HCl或0.1 mol·L^-1NaOH溶液[3]。1992年Steiner[4]从菲牛蛭Hirudinaria manillensis中分离出2 种水蛭素（Hm1，Hm2），黄爱民等[5]也从广西科康生物有限公司的菲牛蛭消化液中分离出菲牛蛭素A（M_r约15 200，等电点3.97）、B（M_r约14 600，等电点4.61）。

乳状液膜体系是由2种或2种以上不互溶的液体形成的分散体系，包括内液相、膜相、外液相3 部分。内液相分散成许多微液滴悬浮在膜相液中构成乳状液，膜相被外液相包裹在内。在一定条件下，外液相中的目的物由膜相内的流动载体协助进入内液相与杂质分离，收集膜相破乳、离心去除溶剂可获得目的物。目前，该项技术主要用于含金属离子、苯酚等废水的洁净处理以及氨基酸、抗生素、生物碱等的提取分离研究[6^-10]。

传统的水蛭素制备主要是用丙酮、乙醇或水提取得到粗提液后，再以离子交换、凝胶色谱或亲和色谱结合等电聚焦等方法纯化[11]，工艺复杂，生产周期长，需要使用昂贵的设备，通常用于实验室小规模制备。

二^-（2^-乙基已基）磷酸（D2EHPA）呈强酸性，为黏稠油状液体，易溶于一般有机溶剂而不溶于水，适合在以辛烷为膜溶剂、稀酸溶液为内水相的乳状液膜体系中作流动载体从外水相萃取溶质。本实验探讨以D2EHPA为流动载体的水蛭素乳状液膜体系萃取工艺条件。过程先将D2EHPA与辛烷及Span80混合，以超声波细胞粉碎仪乳化（超声波乳化）制成乳状液，然后加入一定体积、一定pH稀HCl溶液为内水相，用超声波乳化制成乳状液膜，以水蛭素对照品（对照品）溶液为外水相进行单因素实验，再通过正交实验优化萃取条件。最后用菲牛蛭匀浆的水蛭素粗提液（粗提液）进行分离纯化实验验证萃取条件，为水蛭素乳状液膜萃取提供实验依据。

1材料

水蛭素对照品（从广西菲牛蛭消化液中提取，批号20100312，电泳纯）及冷冻菲牛蛭（批号20100409）均购自广西科康生物有限公司，药材经广东海洋大学理学院制药专业宋文东教授鉴定为菲牛蛭H.manillensis；牛血纤维蛋白原，Biosharp公司（美国）；牛凝血酶（长春国奥药业有限公司）；考马斯亮蓝G250，Fluka公司（瑞士）；酪蛋白，购自上海沪峰生物科技； D2EHPA，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司、辛烷、脱水山梨醇脂肪酸酯（Span80）及其他试剂均为国产分析纯；实验用水全部为广东海洋大学水厂生产的去离子水。

外水相为不同pH、浓度均为1 ATU·mL^-1的对照品溶液或粗提液。膜溶液：辛烷为膜溶剂，D2EHPA为流动载体（膜溶质）。乳状液：流动载体、膜溶剂及乳化剂Span80按一定比例混合，用超声波乳化而得。内水相：不同pH的稀HCl溶液系列。

CR22G型高速冷冻离心机（日本HITACHI公司）；VirTis Benchtop V2K冷冻干燥机（美国VirTis公司）；TU^-1901双光束紫外^-可见光分光光度计（北京普析通用仪器公司）；JY^-SCZ2⁺垂直电泳槽及JY1600C通用型电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）；SCIENTZ^-ⅡD超声波细胞粉碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；PHS^-2F pH计（上海精科雷磁）；EL200电子天平（SHIMADZU）；F100 型数码照相机（日本富士公司）。

2方法

水蛭素分子内含4～5 个碱性氨基酸残基，10～12 个酸性氨基酸残基，属两性电解质，碱性残基分布于分子的中部，酸性残基分散于整个分子[12]。在本实验pH条件下，酸性残基不带电而碱性残基带正电，此时水蛭素分子带少量正电，其正电荷密度小于相同体积的外水相正电荷密度（H⁺浓度）。

2.1原理分析