Bcl—2、Caspase3在三氧化二砷诱导人横纹肌肉瘤RD细胞凋亡中的作用

【摘 要】目的：研究三氧化二砷诱导人横纹肌肉瘤RD细胞凋亡的作用及对Bcl-2、Caspase3表达的影响。方法：采用流式细胞分析术、免疫酶联吸附法及Caspase3活性试剂盒分别测定空白对照组（0umol/l）和三氧化二砷各浓度组（4umol/l、6 umol/l、8 umol/l）作用于横纹肌肉瘤RD细胞株24小时后的细胞凋亡率及凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase3表达的情况。结果：流式细胞分析在8 umol/l组其凋亡率为（46.43±0.531）%最大；凋亡相关蛋白Bcl-2表达下调，Caspase3表达上调，各组间比较差异均有统计学意义（P<0.01）。结论：As2O3可促进RD细胞凋亡，其作用机制可能与抑制凋亡相关蛋白Bcl-2表达，上调Caspase3表达有关。

【关键词】As2O3 ；横纹肌肉瘤；细胞凋亡；Bcl-2；Caspase3

【中图分类号】R73 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）04-0137-03

儿童横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma，RMS）是一种常见的儿童软组织肉瘤，占小儿实体瘤的10%[1，2]，恶性程度极高，发病的高峰年龄在10岁以内，中位年龄为5岁。目前的治疗方案为手术控制原发肿瘤，化疗消灭微小转移灶的综合疗法[3] 。但该方案仍然存在诸多缺憾如：某些部位的肿瘤难以完全切除；放疗对患儿的生长发育有严重的抑制作用；某些患儿对放化疗存在耐受而不敏感等。因此迫切需要找到一种高效低毒的化疗药物。三氧化二砷对治疗急性早幼粒细胞白血病疗效显著，近年来一些实验研究显示As2O3对其他类型的白血病及实体瘤也有不同程度诱导凋亡作用，如有人将其运用到中晚期肝癌的临床治疗中，获得较好疗效，并发现该药较其他化疗药毒性低[4-7]。为进一步扩展As2O3的抗瘤谱，笔者以不同浓度的As2O3作用于体外培养的人胚胎型RMS细胞株RD，探讨As2O3 对RMS的抗肿瘤作用及可能的机制。

1 材料和方法

1.1 材料 As2O3（哈医大药业公司）；Annexin V-FITC试剂盒（北京宝赛公司）；Bradford蛋白浓度测定试剂盒、Caspase3活性试剂盒（上海碧云天公司）；bcl-2酶联免疫分析试剂盒（上海百沃生物公司）；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人横纹肌肉瘤RD细胞株购自中科院上海细胞库。指数生长期的RMS细胞1×105/ml接种于塑料带孔培养瓶中，加含10%小牛血清的改良型1640培养液，置于37℃、含5%CO2饱和湿度的孵箱中常规培养，每3天换液传代一次。

1.2.3 人B细胞淋巴细胞因子2酶联免疫分析法测bcl-2蛋白浓度 收集不同浓度As2O3作用24h后的RD细胞株，提取总蛋白，取适量置于冰浴中，余-20℃保存备用。按照试剂盒说明书进行实验操作，30min内使用酶标仪在450nm下读取吸光度值，并计算出待测标本所含bcl-2蛋白浓度。

1.2.5 数据处理 实验数据以均数±标准差（x¯ ± s）表示，采用SPSS16.0 统计软件行单因素方差分析，p<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 As2O3 对RD细胞凋亡的影响 不同浓度的As2O3作用24h后，RD细胞开始出现凋亡，且随着物浓度不断增加，RD细胞凋亡的凋亡率逐渐增高，结果显示：As2O3能够明显诱导RD细胞凋亡，与对照组相比各组差异具有统计学意义（p<0.01），同时实验组各组间差异仍具有统计学意义（p<0.01），实验结果与龙兴震等[8]的结果相符。

2.2 Bcl-2表达的酶联免疫吸附法检测 肿瘤细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2表达上调，经As2O3干预24h之后，测得Bcl-2的表达下调，并且随药物浓度的增加，其下调幅度逐渐加大，各组间对比差异具有统计学意义（p<0.01，见图3）

3 讨论

三氧化二砷（As2O3）是中药砒霜的主要成分，古代曾用于治疗牛皮癣、梅毒、风湿病及一些恶性肿瘤，在我国已有2400多年的使用历史[9]。上海第二医科大学附属瑞金医院陈国强等，从细胞和分子生物学角度阐明了其作用机理，确定As2O3对全反式维甲酸（ATRA）耐药的病例可获较高的完全缓解（CR）率[10]，而且长期静脉用药并无严重的骨髓抑制等副作用产生[11]。近年来，陆续的报道显示As2O3在治疗肝癌、胃肠癌、膀胱癌、肾癌、骨肉瘤及宫颈癌等[12-15]诸多实体瘤方面取得了令人满意的疗效并不伴有明显全身毒副作用。

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