IFN—γ体外释放法检测牛结核病

摘 要：牛结核病（bovine tuberculosis， bTB）是由牛型分枝杆菌（Mycobacterium bovis）感染引起的一种慢性消耗性人兽共患传染病，其中奶牛为最易感动物。伴随我国奶业的快速发展，奶牛结核病近年来蔓延全国，不仅阻碍着我国奶业的可持续发展，而且严重威胁食品安全和公共卫生。近年发展起来的IFN-γ体外释放法为结核病的诊断提供了新的方向。本研究利用融合蛋白RCE刺激的IFN-γ体外释放法试验对某奶牛场59头奶牛进行检测，确定被检奶牛是否感染结核分枝杆菌。共检出阳性牛44头，阴性牛15头。与结核菌素皮内变态反应相比较，其敏感性为75.6%，特异性为26.1%。本试验为牛结核病IFN-γ诊断试剂盒的研究提供了数据支撑。

关键词：牛结核病；牛型分枝杆菌；IFN-γ；双抗体夹心ELISA方法；结核菌素皮内变态反应；RCE；融合蛋白

1前言：IFN-γ体外释放法是将结核菌特异性加入被检测的牛的血液或者含有外周血单核细胞的培养基中进行孵化，如果被检测的牛受到过结核分枝杆菌的感染，那么被结核菌激活的记忆T淋巴细胞将会对这些特异性抗原产生反应，释放出大量IFN-γ（γ-干扰素），通过检测γ-干扰素的释放水平来判断是否存在结核菌感染。

1.1 牛结核病的流行现状及危害

牛结核病（bovine tuberculosis， bTB）主要是由牛结核分枝杆菌引起的一种人畜共患的慢性传染病。牛结核病在各国均有发生，因为容易传染，并通过牛奶传染给人和牛，危害性很大，被国际动物卫生组织（OIE）定为B类动物传染病，我国将其列为二类动物疫病。牛结核病为慢性消耗性疾病，感染的牛通常会在一定时间后表现临床症状，并将病菌传播给群内其他动物。如果不早检测，易造成牛群大批感染，感染牛日渐消瘦，产奶量降低，降低奶牛的经济价值，而且成为人结核病的传染源。我国结核病的研究比较滞后，虽然政府加大防疫监管力度，但近年来奶牛结核病还时有发生。因此非常有必要加强牛结核病的研究。

1.2 病原

Koch在1882年发现牛的结核病的病原为牛分枝杆菌。牛分枝杆菌属于放线菌目分支杆菌属，该菌为专性需氧菌，是一种细长而稍弯曲杆菌，无鞭毛，无运动性，不形成芽胞，无荚膜，不产生内外毒素，革兰氏染色阳性。分支杆菌含有较厚的蜡脂，因此对外界环境抵抗力较强。阴湿处可生存5个月以上，阳光曝晒2 h，700 mg/L-750 mg/L酒清接触2 min，60℃温度持续10 ～30 min，85℃持续5 min或90 ℃持续1 min均可杀死。对50 mg/L石碳酸、40 g/L氢氧化钠和30 mg/L福尔马林等消毒剂敏感[3]。

1.3牛结核病诊断方法的研究

由于目前牛结核病的防治没有特效的疫苗可以预防，世界各国控制该病主要采用的是“检疫-扑杀”的方法处理此病。因此牛结核病的诊断方法在该病的控制中起着关键的作用。根据感染牛结核分枝杆菌在机体内有一定的病理变化，但临床症状很不明显，因此仅凭症状难以诊断该病。必须用一些特殊的诊断方法进行诊断，这不仅有利于确诊，更可查出隐性病牛。目前，国内外用于诊断牛结核病的检测方法，一般用以下4类：一是细菌学检查方法；二是免疫学方法检测结核菌的特异性抗体；三是分子生物学检测方法；四是细胞因子及细胞因子受体检测法，如IFN-γ试验。

2 研究目的与意义

由于目前为止尚未发现有效药物与疫苗用于牛结核病的防治，根除牛结核病主要采取检疫与扑杀阳性牛的国际通用政策。由于结核菌素可能包含有与其它分枝杆菌相同的非特异性抗原组份，检测时容易出现假阳性，因此，结核菌素皮内变态反应的特异性受到质疑。为了提高检测的灵敏度，人们建立了使用特异性抗原刺激产生IFN-γ检测牛结核病的方法。在国外，IFN-γ体外释放检测方法的使用曾使许多国家在牛结核病的防控上节省了大部分的开支，因此在我国推广该诊断方法是十分迫切与急需的。通过大量的临床诊断试验确定其敏感性与特异性，对该方法的推广和IFN-γ检测试剂盒的研制具有重要意义。但目前该法在国内与皮内变态反应开展的对比试验极少，其敏感性和特异性还需大量数据支持。本研究利用原核表达的融合蛋白RV3872- ESAT-6-CFP-10（RCE）刺激全血，利用双抗体夹心ELISA法检测刺激的全血上清中IFN-γ的含量，并以此诊断牛结核病。同时与皮试方法做比较，为牛结核病IFN-γ检测试剂盒的研制提供数据支撑。

3 材料与方法

3.1 材料

3.1.1 实验动物 奶牛：某地区59头成年奶牛。

3.1.2 主要试剂与仪器

RCE蛋白（实验室自制），抗牛IFN-γ单克隆抗体，兔源抗IFN-γ多克隆抗体，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗；10 mL注射器，肝素钠抗凝管，1.5 mL离心管， 96孔微孔板，可调微量移液器，酶标仪。

3.1.3 ELISA缓冲液的配制

包被液（25 mmol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.6）：Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，ddH2O 加至1 000 mL，4 ℃保存备用。

洗涤液（0.05% Tween-20 PBS，pH 7.4）：NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 2.9 g，KH2PO4 0.2 g，Tween-20 0.5 mL，ddH2O加至1 000 mL。

封闭液：5 g脱脂奶粉溶于100 mL洗涤液，4 ℃保存备用。

底物缓冲液（磷酸盐·柠檬酸盐缓冲液，pH 5.0）：0.2 mol/L Na2HPO4 25.7 mL，0.1 mol/L柠檬酸24.3 mL，ddH2O 50 mL，4℃保存备用。

TMB母液：0.29 TMB干粉溶于l00 mL无水乙醇中配制而成，4 ℃保存备用。

底物液（TMB）（新鲜配制）：TMB母液用底物缓冲液按l∶20的比例稀释，每毫升底物液加入0.2 μL 30% H2O2。

终止液（0.25% HF）：HF（40% ） 625 μL，ddH2O 100 mL。

3.2 方法

3.2.1 牛结核菌素皮内变态反应

3.2.1.1 注射

保定好牛只，在颈侧中部上1/3处剪毛，直径约l0 cm，用卡尺测量术部中夹皮皱厚度，作好记录。术部用酒精棉球消毒，皮内注入0.1 mL牛提纯结核菌素。注射后局部出现小泡为正确。

3.2.1.2 观察并记录结果

注射后，在第72 h进行观察，注意局部有无热、痛、肿胀等炎症反应，并以游标卡尺测量术部肿胀面皮皱厚度，作好详细记录。若皮厚差大于等于4 mm，则为结核菌素阳性牛，记为“+”；若皮厚差小于2 mm，则为结核菌素阴性牛，记为“-”；若在两者之间，为可疑牛，记为“？”。

3.2.2 采血

从以上受试牛中选取皮试结果阳性牛50头与皮试结果阴性牛50头。颈静脉或尾静脉无菌采血，每头牛10 mL，立即注入5 mL肝素钠抗凝管。4 ℃保存。24 h内进行培养。

3.2.3 分别刺激血样

将血样按1 mL/孔分别转移至1.5 mL离心管中。于第1个孔中加入40 μgRCE，作为检测孔；于第2个孔中加入10 μLPBS，作为阴性对照。将孔中各试剂与血液轻轻混合，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养16 h。次日收集上层血清进行夹心ELISA检测。

3.2.4 牛IFN-γ双抗体夹心ELISA方法

3.2.4.1 包被：抗牛IFN-γ单克隆抗体用包被液 1∶5000稀释，然后进行包被，用于检测抗原。每孔100 μL，置4 ℃过夜（至少8 h）；

3.2.4.2 洗板：取出预包被的酶标板，甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，每次300 μL/孔，每次静置3 min倒掉，最后一次拍干（洗板机通常洗板4次，静置1 min，每次200 μL/孔）；

3.2.4.3 封闭：每孔加入200 μL封闭液封闭，需4 ℃过夜，或放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养1 h；

3.2.4.4 洗板：方法同上。

3.2.4.5 加抗原（提纯BovIFN-γ或全血刺激产物） ：加入刺激后的血清，100 μL/孔，37 ℃作用45 min；

3.2.4.6 加夹心的兔源抗IFN-γ多克隆抗体：加入稀释至最佳浓度的多克隆抗体，100 μL/孔（这里使用的是兔源抗IFN-γ多克隆抗体，用洗涤液1∶1600稀释）。37 ℃作用1 h；

3.2.4.7 洗板：方法同上。

3.2.4.8加二抗：加入1∶10000倍稀释的羊抗兔HRP-IgG二抗，100 μL/孔，37 ℃作用30 min；

3.2.4.9 洗板。每孔加入300 μL，洗涤5次，最后一次拍干。

值得注意的是，因二抗不易洗净，而未洗净的二抗干扰实验结果，可能导致假阳性增多或阳性值偏高。所以洗板时应多洗一次，每次拍板时都要拍得较干。

3.2.4.10 显色：每孔加底物液A、B各50 μL，混匀，室温避光显色10 min；每孔加50 μL终止液终止反应。

3.2.4.11 读数：测各孔在630 nm处的吸光度（OD630 nm）。

3.2.5 结果判定：ODRCE-OD阴性对照≥0.1为阳性；否则为阴性。

4 结果与分析

4.1 59头奶牛检测结果

对某奶牛场临床检测的奶牛中，采集单次皮内变态反应阳性牛（37头）和阴性牛（22头）全血用于抗原特异性IFN-γ试验检测牛结核病。用RCE和PBS刺激全血，16 h后用双抗体夹心ELISA方法检测上清中IFN-γ含量，以此判断是否感染牛结核分枝杆菌。利用IFN-γ方法共检出RCE（见表1）。

4.2 两种方法的符合率、敏感性和特异性比较

本实验分别用结核菌素皮内变态反应试验（TST）与牛结核病IFN-γ试验检测了59份奶牛样本，比较两种方法检测的结果。其中37头皮内变态反应阳性牛中检出IFN-γ牛型结核阳性28头，阴性9头；22头皮内变态反应阴性牛中检出IFN-γ牛型结核阳性16头，阴性6头。以结核菌素皮内变态反应试验结果为标准，IFN-γ体外释放法的敏感性为75.6%，特异性为26.1%，总符合率为54.5%。结果见表2。

5 讨论

皮内变态反应，由于存在交叉反应，时常发生非特异性的反应，造成误判；同时该法敏感性较低，经常会出现假阳性和假阴性反应，故OIE认为仅用单一的结核菌素试验进行根除此病很难，且皮内变态反应由于受迟发型变态反应的影响，在30 天内不能进行复检，造成了病原的扩散和疫情处置的延误。

近年来发展的抗原特异性IFN-γ试验用于牛结核病的诊断因其敏感性和特异性较强，检出时间短而备受关注。另外，IFN-γ试验由于减少了结核菌素皮内变态反应试验中操作和解释上的主观性，使结果更为客观、可靠。有些对牛群进行卡介苗免疫的国家或地区，由于卡介苗中含有与牛型结核菌素相同的抗原成分，因而结核菌素皮内变态反应并不能够鉴别免疫动物与感染动物。而此法能够避免使许多非结核牛被误判为结核牛，造成不应有的损失。与结核菌素皮内试验相比， IFN-γ测定法不仅简单、快速，灵敏度高，而且能鉴别出早期感染牛分枝杆菌的牛，从而降低了传染的风险。所以IFN-γ测定法可用于对检出阳性和可疑牛进行复检。

RCE是牛结核分枝杆菌特异性抗原，理论上讲，用RCE刺激全血的IFN-γ体外释放法检测牛结核病时，其敏感性和特异性很好。而本实验中，IFN-γ试验共检出阳性牛44头，与TST 方法比较符合率偏低，可能的原因主要有以下几个方面：第一，因TST操作有着本身固有的缺陷，TST试验引起的非特异性反应现象严重，如牛分枝杆菌感染初期、封闭型结核、非典型分枝杆菌干扰等；第二，TST的操作和结果判断容易掺杂操作者的主观因素，不同的操作者之间经常存在明显的误差，在一定程度上影响了IFN-γ试验与TST的符合率；第三，机体在使用药物治疗或免疫抑制时，可能引起TST假阴性结果；第四，本实验涉及的牛场结核阳性率比较高，早中晚期感染牛均存在，而TST对晚期感染牛的敏感性很低，而IFN-γ不受此影响，故影响了阴性符合率。

我们相信，通过对RCE融合蛋白刺激条件的不断改良，对夹心ELISA反应条件的进一步优化，以及对该方法操作步骤的标准化，将提高IFN-γ体外释放法检测牛结核病的敏感性和特异性。而开展更为广泛的田间试验，将使该方法在我国牛结核病诊断和流行病学调查中的应用将成为可能，尤其在与TST试验共同检测，将提高检测的准确性，更适用于水牛结核病的确诊和对阳性牛的扑杀，有利于结核病牛“检疫-扑杀”策略的开展。（编辑：何芳）