荧光定量PCR单探针法与双探针法对甲型H1N1流感检测的对比分析

【摘要】目的对比分析荧光定量PCR单探针法与双探针法对甲型H1N1流感检测的灵敏度、特异性及准确率，总结其临床应用价值。方法选取我院2009年11月至2011年11月流感样的病例268例，分别留取其鼻咽拭子样本送实验室，分别采取进行荧光定量PCR单探针法与双探针法进行甲型H1N1流感检测，观察对比两种检测方法的检出率、灵敏度、特异性及准确率，进行统计学分析。结果两种方法检测的灵敏度、特异性及准确率相对皆无明显差异（P＞0.05），无统计学意义。两种方法检测的出结果时间及检测费用对比有明显差异（P＜0.05），具有统计学意义。结论荧光定量PCR单探针法与双探针法对甲型H1N1流感检测的灵敏度、特异性及准确率间无明显差别，皆能有效地检出甲型H1N1流感病毒，但两种方法各自有其优缺点；临床实践中应根据实际需要，选择性价比高的方法进行检测，具有重要的临床意义。

【关键词】荧光定量PCR；单探针法；双探针法；甲型H1N1流感

目前，临床上对流感爆发疫情病原学检测和监测中，一般常用的病毒分离培养法、PCR检测法、胶体金快速检测法等，本研究通过对比分析荧光定量PCR单探针法与双探针法对甲型H1N1流感检测的灵敏度、特异性及准确率，总结其临床应用价值如下：

1资料与方法

1.1一般资料选取我院2009年11月至2011年11月流感样的病例268例，男有131例，女有137例，年龄在6-34岁，中位年龄为16.6±2.3岁，入院时临床表现为发热（体温在38摄氏度或以上）、咽痛/咳嗽，分别留取其鼻咽拭子样本送实验室，分别采取进行荧光定量PCR单探针法与双探针法进行甲型H1N1流感检测，观察对比两种检测方法的检出率、灵敏度、特异性及准确率，进行统计学分析。

1.2方法

1.2.1单探针法

1.2.1.1采集方法将鼻咽拭子样本放进Hanks液中，采集后24h内检测的样本可在4-8摄氏度下进行保存，采集后无法在24h内进行检测的样本将其置入到零下70摄氏度下进行保存。

1.2.1.2试剂盒与检测方法使用的是实时荧光PCR仪（美国应用生物公司生产，型号：7300），甲型H1N1流感病毒的RNA检测试剂盒（北京金豪制药股份公司提供），提取试剂使用的是Qiagen核酸分离的提取试剂盒（QIAampViralRNAMiniKit（50）提供，型号：Cat.No.52904），采取荧光PCR法进行检测；皆按照试剂盒上说明书进行严格操作，共配制出SWFluAl、SwHl、FluA三种反应液，其检测通道皆为FAM，在严格质控下完成操作。

1.2.2双探针法

1.2.2.1采集方法：同上。

1.2.2.2试剂盒与检测方法：使用的是实时荧光PCR仪（美国应用生物公司生产，型号：7300），用H1N1型和甲型流感通用型的病毒核酸双检试剂盒（上海科华生物工程股份有限公司提供），核酸提取的试剂盒采取自行配置，采取荧光PCR法进行检测；皆按照试剂盒上说明书进行严格操作，仅配置一种反应液，其检测通道是VIC（F1uA信号）与FAM（H1N1RNA信号），在严格质控下完成操作。

1.2.3结果判断以阴阳性的对照皆成立作为前提条件，Ct值为无数值或者超过40，认为呈阴性反应；Ct值在36-40时，给予重新检测；Ct值的FluA为阳性或者在36以下，认为呈阳性反应［1］。

1.3统计学方法本组检出率、灵敏度、特异性及准确率的数据采取SPSS13.0软件进行统计学处理，期间的数据比较使用t检验，χ±s作为计量单位；结果时间及检测费用的数据采取卡方软件V1.61版本进行统计学处理，期间的数据比较使用X2检验，%作为计量单位，以P＜0.05为有统计学意义。

2结果

268例样本中，荧光定量PCR单探针法检出阳性率为76.9%（206/268），双探针法检出阳性率为75.7%（203/268），两种方法的检出率对比无明显差异（P＞0.05），无统计学意义；对两种方法的检出阳性的样本病例随访一个月，最终得到临床确诊的有203例，进行荧光定量PCR单探针法检测漏诊3例，灵敏度为98.5%，无误诊案例，特异性为100%，准确率为98.5%；双探针法检测漏诊5例，灵敏度为97.5%，误诊5例，特异性为97.5%，准确率为95.1%，两种方法检测的灵敏度、特异性及准确率相对皆无明显差异（P＞0.05），无统计学意义。两种方法检测的出结果时间及检测费用对比有明显差异（P＜0.05），具有统计学意义，见表1、表2。

3讨论

流感病毒是一种传播速度极快，且容易引发大流行的一种疾病，以甲型流感病毒的传染性及感染能力最强，具有较大的危害性，过去曾数次引发了世界性的流感大流行，因此，对甲型H1N1流感进行实时监测，对于其防控、早诊断和早对症治疗有非常重要的临床意义。本研究中分别采取荧光定量PCR单探针法与双探针法对疑似甲型H1N1流感的268例流感样病例进行检测，荧光定量PCR单探针法检出阳性率为76.9%，灵敏度为98.5%，特异性为100%，准确率为98.5%；双探针法检出阳性率为75.7%，灵敏度为97.5%，特异性为97.5%，准确率为95.1%，两种方法检测的灵敏度、特异性及准确率相对皆无明显差异；显示出两种方法在检出甲型H1N1流感病毒的核酸中皆有较好的效果。另外，本研究中还统计发现，两种方法检测的出结果时间及检测费用对比有明显差异，单探针法检测的出结果时间对比双探针法要长，但检测费用对比双探针法要低，主要是两种方法在核酸的提取、探针的设计和引物的选择上皆有一定差异，单探针法需要配置三对反应液，操作相对复杂，核酸提取试剂采用的是Qiagen法，操作相对费时；而双探针法仅配置一对反应液即可，操作相对简化，且使用H1N1型和甲型流感通用型的病毒核酸双检试剂盒，其提取效率较高，能够完成大量的样品检测［2］。

综上所述，荧光定量PCR单探针法与双探针法对甲型H1N1流感检测的灵敏度、特异性及准确率间无明显差别，皆能有效地检出甲型H1N1流感病毒，但两种方法各自有其优缺点，荧光定量PCR单探针法与双探针法对甲型H1N1流感检测皆有个字的优势与局限性，其中单探针法检测灵敏度、特异性的精确度相对双探针法稍高些，但检测耗时较双探针法长；双探针法检测耗时短，操作简便，能够完成大批量的临床样本筛查并迅速出结果，但检测费用相对较昂贵，临床实践中应根据实际需要，选择性价比高的方法进行检测，具有重要的临床意义。

参考文献

［1］石伟先，黄芳，崔淑娟，等.实时荧光PCR法胶体金快速检测法及病毒分离培养法在甲型流感病毒检测中的临床应用分析［J］.中国卫生检验杂志，2011，21（11）：2690-1692.

［2］何颖，吴锦如.荧光定量PCR单探针法与双探针法对甲型H1N1流感检测的比较［J］.实用预防医学，2010，17（9）：1856-1857.