PCR反向膜杂交法在CT、UU、NG三种性病筛查中的应用价值

【摘要】 目的：探讨PCR反向膜杂交法在CT、UU、NG三种性病筛查中的应用价值。方法：对1486例疑为泌尿生殖道感染患者分别采用PCR反向膜杂交法及荧光定量PCR（FQ-PCR）检测，并将检测结果与培养结果比较。结果：FQ-PCR检测CT、UU、NG阳性率高于培养法，比较差异有统计学意义（P<0.01）；PCR反向膜杂交法与培养法及FQ-PCR检测阳性率比较差异均无统计学意义；PCR反向膜杂交法、FQ-PCR检测敏感性比较差异无统计学意义，但PCR反向膜杂交法检测特异性高于FQ-PCR，比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论：PCR反向膜杂交法筛查CT、UU、NG准确，快速，且筛查特异性高于FQ-PCR，值得临床推广适用。

【关键词】 PCR反向膜杂交法； 荧光定量PCR； CT； Uu； NG

PCR Reverse Hybridization Membrane Applications in Screening of CT， UU， NG Three Kinds of STD/WANG Tao， WANG Peng， DONG Li.//Medical Innovation of China，2014，11（31）：055-057

【Abstract】 Objective： To investigate the value of PCR reverse hybridization membrane application in screening of CT， UU， NG three kinds of STD. Method： 1486 suspected patients with genitourinary tract infections were detected by PCR reverse hybridization membrane and fluorescence quantitative PCR （FQ-PCR）， and test results were compared with culture results. Result： FQ-PCR detection of CT， UU， NG was higher than culture （P<0.01）. PCR reverse hybridization membrane， culture and FQ-PCR positive rate difference was not statistically significant. PCR reverse hybridization membrane， FQ-PCR detection sensitivity difference was not statistically significant， but the film PCR reverse hybridization assay specificity was higher than FQ-PCR （P<0.01）. Conclusion： PCR reverse hybridization in screening of CT， UU， NG， is accurate， rapid， and specific is higher than FQ-PCR， worthy of promotion apply.

【Key words】 PCR reverse hybridization membrane； Fluorescence quantitative PCR； CT； Uu； NG

First-author’s address： Yongcheng People’s Hospital， Yongcheng 476600， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.31.019

沙眼衣原体（CT）、解脲脲原体（Uu）及淋球菌（NG）是性病的主要病原体。近年研究表明，采用常规PCR扩增产物，再采用膜杂交技术鉴定扩增产物，可保持杂交特异性，诊断正确率高[1-3]。本研究对1486例疑为泌尿生殖道感染的患者采用PCR反向膜杂交法筛查，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 1486例为2013年1月-2014年6月到本院治疗的疑似泌尿生殖道感染患者，大部分患者存在外阴搔痒、不适等症状，已将1个月内使用过抗支原体、衣原体药物者剔除。其中男634例，女852例；年龄17～60岁，平均（33.6±5.7）岁。

1.2 检测方法

1.2.1 仪器与试剂 人乳头状瘤病毒分型检测试剂盒（深圳生化有限责任公司生产）；MJopticon2型FQ-PCR扩增分析仪及其配套试剂（美国生产）；CT快速检测卡，UU、NG培养基（潮州凯普生物化学有限公司生产）。

1.2.2 标本采集 男性标本：将消毒棉拭子伸入受检者尿道口中1～2 cm，旋转10 s取分泌物。女性标本：将消毒棉拭子插入宫颈1～2 cm处，旋转20 s取上皮细胞。男、女各取3份分泌物标本。

将其中两份置入1 mL无菌生理盐水试管中，加入2 mL漂洗液放入离心机中进行12 000 r/min离心处理15 min，随后在离心沉淀中滴入50 μL DNA提取液，摇匀后放入100 ℃沸水中浸浴15 min；随后再进行15 000 r/min离心处理10 min，取5 μL上清液进行扩增处理[4]。

另1份标本置入培养基中培养，CT采用Hela-229及McCoy细胞培养，培养24 h；将UU培养基放入37 ℃左右的温箱中培养，48 h后观察标本颜色；NG接种于巧克力平板，置于37 ℃温箱培养，加入5% CO2，培养24 h[5]。

1.2.3 PCR扩增反应 取处理好的上清液进行PCR扩增反应，均严格按照说明书要求操作。每次检测均设阴性、阳性及空白对照。

1.2.4 膜杂交反应 （1）DNA变性：将20 μL DNA变形液加入扩增后的上清液中，摇匀放置2 min充分反应。（2）杂交：在酶板条第一排孔中加入40 mL杂交缓冲溶液A，按顺序滴入10 μL变性DNA液，摇匀后插入对应杂交膜，于37 ℃恒温箱中放置5～10 min。（3）洗膜：在酶板条第二排孔中滴入1滴杂交缓冲液B，将之前制成的杂交梳按序号置入，放入37 ℃恒温箱中7～10 min。（4）酶结合：在酶板条第三排孔中滴入1滴SA-AP，按顺序将前面第二排杂交梳插入对应孔中，放入25 ℃恒温箱中7～10 min。（5）显色：在酶板条第四排孔中分别滴入1滴显色物液 A和显色物底物液B，混匀后将之前第三排杂交梳插入对应孔中，放入25 ℃恒温箱中5～10 min[6]。

1.2.5 FQ-PCR扩增反应 取1份离心处理后的上清液，按照试剂盒的操作要求置入反应管中，上机进行FQ-PCR扩增反应。反应条件为：93 ℃ 2 min预变性；93 ℃ 45 s，55 ℃ 1 min，10个循环；93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，30个循环[7]。每次检测均设阴性、阳性及空白对照，以试剂盒中给出的DNA浓度作标准曲线，以此标准定量法测定。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0软件包对数据行统计学分析，计数资料采用 字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 检测结果 1486例患者中，培养法检测出947例（63.73%）阳性，539例（36.27%）CT、UU、NG全阴性。FQ-PCR阳性率为70.25%，与培养法比较差异有统计学意义（ 字2=14.31，P<0.01）；PCR反向膜杂交法阳性率为66.96%，与培养法比较差异无统计学意义（字2=3.42，P>0.05）。FQ-PCR、PCR反向膜杂交法阳性率比较差异无统计学意义（字2=3.75，P>0.05）。见表1。

2.2 检测敏感性及特异性 以培养法检测结果作为金标准，FQ-PCR、PCR反向膜杂交法检测的敏感性均为100%；FQ-PCR检测的特异性为82.00%，PCR反向膜杂交法为91.09%，两组比较差异有统计学意义（字2=19.13，P<0.01）。见表2。

表2 FQ-PCR、PCR反向膜杂交法检测敏感性及特异性 例（%）

培养法检测结果FQ-PCR

PCR反向膜杂交法

阳性阴性阳性阴性

阳性（n=947）947（100）0947（100）0

阴性（n=539）97（18.00）442（82.00）48（8.91）491（91.84）

合计（n=1486）1044442995491

3 讨论

CT、UU及NG是性传播疾病的主要病原体。然而，这3种病原体感染症状不典型，部分患者甚至无任何症状，这给病原学诊断带来挑战。本文尝试采用PCR反向膜杂交法筛查CT、UU及NG三种性病[8]。

培养法是性病病原体检测的常规方法，但其培养时间较长，一般需要2～3 d才能获得检测结果，同时其对检测设备及操作要求较高[9-10]。FQ-PCR法以其简便、微量、快速等优势而成为CT、UU、NG三种性病筛查的首选方法。FQ-PCR其是在原有PCR技术的基础上，将荧光能量传递技术融合进来，通过电脑控制检测实现了对扩增病原体的实时动态观察，可较准确地反映病原体感染情况[11]。然而，FQ-PCR探针无法保持杂交特异性，在检测中易产生非特异性及假阳性产物，使假阳性偏高。

随着分子生物技术的发展，膜杂交技术逐渐应用于性病筛查中。PCR反向膜杂交技术应用DNA探针、核酸杂交，酶联显色等多种技术进行CT、UU、NG三种性病病原学检测[12]。其利用PCR技术扩增产物，随后采用核酸杂交、酶联显色对扩增产物进行鉴定，检测准确性高[13]。本组中，PCR反向膜杂交法检测阳性率略低于FQ-PCR，但两组差异比较无统计学意义。由此可知，PCR反向膜杂交法检与FQ-PCR有着同样准确检测优势。PCR反向膜杂交法中的扩增产物用生物素标记后，其固定在膜条上的特异性探针进行反向膜杂交，探针捕获的生物素标记和流动相中的靶序列特异性结合，酶催化底物显色，并在膜上显出蓝色斑点[14]。膜杂交技术需要在固相载体膜上交联特异性探针能够很好的保持杂交的特异性，同时在试剂盒中加入duTP和UDCT酶等可消除扩增产物被污染对结果的干扰，可克服FQ-PCR的缺点[15]。本组中，PCR反向膜杂交法与FQ-PCR检测的敏感性均为100%，证实两种方法均可作为CT、UU、NG三种性病筛查的敏感性方法。但PCR反向膜杂交法检测特异性显著高于FQ-PCR（P<0.01）。由此可知，PCR反向膜杂交法可避免FQ-PCR检测所具有的假阳性偏高的缺点。

综上所述，PCR反向膜杂交法筛查CT、UU、NG准确，快速，且筛查特异性高于FQ-PCR，值得临床推广适用。

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（收稿日期：2014-07-23） （本文编辑：王宇）