利用定量ＰＣＲ方法检测盐、磷对菌根真菌侵染紫云英的影响

摘要：建立了菌根真菌（ＡＭF）的ＤＮＡ含量和ＴＢ染色所观察的侵染率之间的相关性曲线。将荧光定量ＰＣＲ技术运用到ＡＭＦ对植物紫云英（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ．）的侵染率检测中，实现了混合侵染条件下对菌根中ＡＭＦ的种类和侵染率同时进行定性和定量检测。在盆栽实验中，利用所建立的方法检测了不同盐、磷浓度及交互作用对ＡＭＦ侵染紫云英的影响，结果表明，不同磷浓度下，盐浓度的增加对Ｇｌｏｍｕｓ ｍｏｓｓｅａｅ和Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ侵染率的影响不同。Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ在混合接种中占有绝对的优势。从ＡＭＦ对紫云英的促生效果上看，ＡＭＦ侵染率的增加提高了紫云英的抗盐胁迫能力，促进了植物生长。

关键词：定量ＰＣＲ；菌根真菌（ＡＭF）；紫云英（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ．）；盐胁迫；磷

中图分类号：Ｑ９３９．５ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）15－3193-05

Ｕｓｉｎｇ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ａｎｄ Ｓａｌｔ ｏｎ ｔｈｅ

Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＭ Ｆｕｎｇｕｓ ｔｏ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ.

ＺＨＯＵ Ｙａｎ－ｆｅｉ，ＬＩＮ Ｈｕｉ，ＺＨＡＯ Ｂｉｎ

（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ｆｕｎｇａｌ ＤＮＡ ａｎｄ ｆｕｎｇａｌ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｓｙｓｔｅｍ were established ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ＴＢ ｓｔａｉｎ ｍｅｔｈｏｄ. Tｈｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ was ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ＡＭF ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ mixture ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｌｉａｂｌｙ． Ｉｔ ｃould ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉａｌ ｔａｘａ ｏｆ ＡＭＦ ｉｎ ｒｏｏｔｓ ａｎｄ ｓｏｉｌｓ ｃｏｌｏｎｉｚｅｄ ｂｙ ｓｅｖｅｒａｌ ｔａｘａ． Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｓａｌｔ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｏｎ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＭ ｆｕｎｇａｌ ｔｏ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ， which was ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｗｉｔｈ ａ ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｗａｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ， ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓe ｏｆ ｓａｌｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｈａｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｌｏｍｕｓ ｍｏｓｓｅａｅ ａｎｄ Ｇ. ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ ｔｏ ｈｏｓｔ ｐｌａｎｔｓ． Ｗｈｉｌｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｉｘ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ， ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｕｓｕａｌｌｙ ｄｏｍｉｎａｔｅｄ ｂｙ Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｑＰＣＲ； ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ ｆｕｎｇｉ； Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ．； ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ； ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ

目前全世界已有８亿ｈｍ２的土地出现盐渍化［１］，严重影响了土地资源的利用，盐胁迫造成的低水势、Ｎａ＋毒害作用和营养元素分布不均衡，可使植物减产甚至不生长［２］。菌根真菌（ＡＭＦ）作为一类可以与地球上８０％的陆生植物共生的古老微生物［３］，能促进植物对土壤中Ｆｅ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｐ等矿质元素的吸收，调节宿主植物的代谢活动［４］，提高宿主植物抗重金属、抗旱和抗盐胁迫能力。盐对菌根的影响主要表现在减少孢子数量和抑制菌丝生长［５］，减少其再次侵染宿主的机会，降低菌根侵染率。尽管存在这种抑制作用，仍有大量研究结果表明ＡＭＦ可以提高宿主抗盐胁迫能力，不同ＡＭＦ抗盐胁迫的能力不一样，对植物生长的促生效果也不同［６］。

在生态系统中，同一宿主植物能被多种ＡＭＦ同时侵染，利用传统的ＴＢ染色和形态学观察方法难以对菌根中不同的ＡＭＦ进行区分［７，８］。而分子生物学方法可用于检测混合侵染的菌根中ＡＭＦ的组成［９］。实时荧光定量ＰＣＲ技术可以准确测定样品中特定基因的拷贝数。Ａｌｋａｎ等［１０，11］对Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ设计特异性引物，使用荧光定量ＰＣＲ方法第一次对单接种条件下菌根中ｒＤＮＡ进行了绝对定量，研究表明菌根总侵染率（包含菌丝、丛枝、泡囊）和荧光定量ＰＣＲ测得的结果之间具有相关性，相关性程度大小与宿主植物联系紧密。随后，进一步将该方法应用在双接种研究中，分别检测Ｇｌｏｍｕｓ ｍｏｓｓｅａｅ和Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ在不同处理时的侵染率变化，发现不同处理下Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ在苜蓿中都占绝对优势。Ｇａｍｐｅｒ等［１2］运用实时荧光定量的方法对５种ＡＭＦ进行定量分析，发现孢子数量和定量ＰＣＲ检测的结果之间有很强的相关性，定量ＰＣＲ方法的可行性取决于具体的实验内容，这种方法是研究生态系统中特定的ＡＭＦ总核酸量的有效方法。

本研究探讨单接种条件下Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ和Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ用定量ＰＣＲ方法检测的结果与ＴＢ染色观察结果之间的相关性，建立了定量ＰＣＲ方法检测混合接种条件下各种ＡＭＦ侵染率的方法。在此基础上以紫云英为宿主植物，Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ和Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ为试验菌种，设置盐和磷交互作用的盆栽实验，定量ＰＣＲ方法检测了盐、磷交互作用下两种ＡＭＦ侵染紫云英的变化，比较单接种和双接种条件下每种ＡＭＦ侵染的变化。

１ 材料与方法

１．１ 实验材料

供试植物：紫云英（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ．），种子消毒、催芽方法参考Ｐｅｎｇ等［８］的实验方法。

供试真菌：Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ。原始菌种由北京农林科学院提供，以此进行扩繁，将ＡＭＦ侵染紫云英６个月的混合物作为接种剂，其中含有被感染的植物根段、ＡＭＦ菌丝、孢子和盆栽土壤混合物。

供试土壤：采自华中农业大学实验田，土壤经自然风干后磨碎并过２ ｍｍ的筛网，将河沙洗净晒干后与土２∶１（Ｖ／Ｖ）混合均匀，１２１ ℃间歇灭菌３次。土壤理化性质：ｐＨ ６．５９，电导率为７３．６ μＳ／ｃｍ，速效磷含量为１１．８３ ｍｇ／ｋｇ。

１．２ 实验方法

１．２．１ 定量ＰＣＲ方法的应用 用粗提法提取紫云英ＤＮＡ［８］，利用嵌套ＰＣＲ方法获取紫云英ＬＲ１－ＮＤＬ２２区段间的序列［４］。将获得的序列在ＮＣＢＩ上进行比对（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ），分别设计上述３个物种的特异性引物并用普通ＰＣＲ进行验证，ＰＣＲ反应程序参考Ｐｅｎｇ等［8］的方法。

分别提取Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅ、Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ和紫云英的ＤＮＡ，测定浓度后，利用荧光定量ＰＣＲ技术分别建立两种ＡＭＦ孢子、紫云英ＤＮＡ浓度和ＣＴ值关系的标准曲线。为了进一步检验ＡＭＦ引物的特异性和敏感性，将ＡＭＦ的孢子ＤＮＡ做梯度稀释，分别与一定量的紫云英ＤＮＡ混合，建立混合体系中ＡＭＦ孢子ＤＮＡ的标准曲线。在此基础上，制备一系列不同侵染率根样［１０］，提取ＤＮＡ，用荧光定量ＰＣＲ进行扩增，计算不同侵染率下ＣＤＮＡ（ＡＭＦ）／ＣＤＮＡ（plant）与ＴＢ染色显微观察的侵染率之间的相关性。

荧光定量ＰＣＲ采用ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ公司）试剂，反应体系：２０ μＬ体系中含有１０ μＬ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｋｉｔ， ０．５ μｍｏｌ上、下游引物，２．０ μＬ ＤＮＡ模板，补水至２０ μＬ。反应在ＡＢＩ７３００荧光定量ＰＣＲ仪进行，ＰＣＲ反应程序：９５ ℃（２０ ｓ）、９５ ℃（２０ ｓ）、６０ ℃（２０ ｓ）、７２ ℃（３０ ｓ），进行４０个循环；然后进行溶解曲线分析。

１．２．２ 盆栽实验 以ＫＨ２ＰＯ４的方式加入磷，盐胁迫处理使用ＮａＣｌ。实验设置３个磷水平（０、３０、６０ ｍｇ／ｋｇ）和３个盐水平（０、０．３５、１．０５ ｇ／ｋｇ），共９种处理，每种处理设置不接种、单接种Ｇ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅ、单接种Ｇ ｍｏｓｓｅａｅ和双接种（１∶１，Ｖ／Ｖ）４种接种方式，共３６个处理，每个处理３次重复，共计１０８盆。每盆装土５００ ｇ，接种处理每盆加１３％接种剂，对照组加等量灭菌的接种剂。参照“１．１”的方法进行种子灭菌和催芽。

１．２．３ 侵染率测定 第７周收获时将植株取出、洗净后，取新鲜根０．２ ｇ用于抽提ＤＮＡ，用荧光定量ＰＣＲ方法检测ＡＭＦ侵染率。实验数据用ＳＰＳＳ １６．０进行统计分析。

２ 结果与分析

２．１ 定量ＰＣＲ方法中特异性引物的设计及验证

分别以植物、Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ孢子、Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ孢子的ＤＮＡ为模板，用各自的特异性引物对上述３种模板行进行验证（图１，从左往右胶图顺序分别是Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ， Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ和紫云英特异性引物验证结果，１－５泳道的模板分别为负对照，紫云英，Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ，５０ ｂｐ Ｌａｄｄｅｒ Ｍａｒｋｅｒ）。ＡＭＦ及植物的引物都具有特异性，通过在荧光定量ＰＣＲ仪器上进行验证，各自的溶解曲线为单峰，说明这３对引物可以用于荧光定量ＰＣＲ方法中，引物序列及名称：ＬＲ１－ＮＤＬ２２［８］，Ｇｉ－Ｒ／ＲＴ－Ｆ：ＡＡＴＣＡＧＣＣＴＴＴＣ

ＧＧＧＴ，ＴＡＣＣＧＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＡＴＧ；Ｍｏｓ－Ｆ／Ｍｏｓ－Ｒ［１１］，ＡＳＦ６／ＡＳＲ６［１３］。

２．２ ＡＭＦ和紫云英ＤＮＡ标准曲线建立

分别用Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ、Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ、紫云英的特异性引物进行ＰＣＲ，得到荧光定量ＰＣＲ的ＣＴ值与各自ＤＮＡ浓度之间的标准曲线（图２）。Ｇｉ－Ｒ／ＲＴ－Ｆ扩增的ＤＮＡ浓度范围为３．２×１０－３～３２.0 ｎｇ，线性方程为ｙ＝－３．１９１ｘ＋２７．２５０，Ｒ２＝０．９９９ ０（图２ａ）；Ｍｏｓ－Ｆ／ Ｍｏｓ－Ｒ扩增的ＤＮＡ浓度范围在１．６×１０－３～２５.0 ｎｇ， 线性方程为ｙ＝－３．２１９ｘ＋２４．１６７，Ｒ２＝０．９９８ ９（图２ｂ）；ＡＳＦ６／ＡＳＲ６扩增的ＤＮＡ浓度范围为３．５×１０－４～３５.0 ｎｇ，线性方程为ｙ＝－３．４０３ｘ＋２１．２７０，Ｒ２＝０．９９９ ６（图２ｃ）。扩增效率分别是１０５．４％、１０５．５％、９８．８％。

２．３ 定量ＰＣＲ检测ＡＭＦ特异引物的灵敏性

在模拟实验条件下，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ ＤＮＡ （０．０１６，０．０８０，０．４００，２．０００，１０．０００，５０．０００ ｎｇ）分别与３５．０、１１．７和３．５ ｎｇ（图３a）紫云英ＤＮＡ混合，扩增的ｌｏｇＣＤＮＡ与ＣＴ值之间的线性方程分别为，ｙ＝

－３．３０３ｘ＋２８．２３７，Ｒ２＝０．９９６ ８；ｙ＝－３．５２６ｘ＋２８．７３１， Ｒ２＝０．９９４ ０；ｙ＝－３．２５６ｘ＋２８．５３４，Ｒ２＝０．９９０ ９；扩增效率分别为１００．７７％，９６．３１％，９７．６5％。Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ ＤＮＡ（０．０８０，０．４００，２．０００，１０．０００，５０．０００ ｎｇ） 分别与１５．０、５．０和１．０ ｎｇ（图３b）紫云英ＤＮＡ混合，扩增的ｌｏｇＣＤＮＡ与ＣＴ值之间的线性方程分别为ｙ＝－３．３９６ｘ＋２５．５５５，Ｒ２＝０．９９７ ５；ｙ＝－３．４２９ １ｘ＋２５．６０２，Ｒ２＝０．９９７ ８；ｙ＝－３．３０８ｘ＋２５．２１６，Ｒ２＝０．９９５ ８，扩增效率分别为９９．３３0％，９７．９９６％，９７．６４８％，１０６．８０８％。当ＡＭＦ的ＤＮＡ模板浓度在０．０１６～５０．００0 ｎｇ范围内都能得到良好的扩增，这说明ＡＭＦ的特异引物可以在混杂ＤＮＡ存在时准确、灵敏地检测出目的基因。

２．４ 根样侵染率与ＣＤＮＡ（ＡMＦ）/ＣＤＮＡ（pｌａｎｔ）线性关系模拟

在模拟实验下确定了ＡＭＦ引物在荧光定量ＰＣＲ运用于ＡＭＦ ＤＮＡ检测具有特异性及灵敏性的基础上，用盆栽实验的根样，建立ＣＤＮＡ（ＡMＦ）/ＣＤＮＡ（pｌａｎｔ） 与ＴＢ染色显微观察结果之间的关联性。结果表明ＣＤＮＡ（ＡMＦ）/ＣＤＮＡ（pｌａｎｔ）与侵染率有明显的相关性（Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ，ｙ＝０．１０６ ７ｘ－０．００４ ９，Ｒ２＝０．９６７ ６）； Ｇ． ｉｎｔｒａｄｉｃｅｓ，ｙ＝０．１２１ ２ｘ＋０．００２ ３，Ｒ２＝０．９６１ ８）（图４）。利用ｑＰＣＲ方法检测出实际根样中的ＣＤＮＡ（ＡMＦ）/ＣＤＮＡ（pｌａｎｔ）值随着侵染率的变化而呈现出相应的变化，表明本方法可以用于直接检测实际侵染根样中各种ＡＭＦ的侵染率。

２．５ 不同处理对ＡＭＦ侵染紫云英的影响

定量ＰＣＲ检测的结果得到不同ＡＭＦ对植物的侵染率如图５。在低磷时，盐浓度增加，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ侵染率逐渐降低；中磷和高磷条件下随着盐浓度的增加，其侵染率先升高后降低。高盐浓度处理时，其ＤＮＡ含量分别减少了６１．５８％、２８．０７％、１５．４６％，说明Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ的侵染率随着盐浓度的增加而降低，在高盐浓度时，与正常盐浓度下相比，其相对ＤＮＡ含量分别减少了５１．５４％、６６．２０％、６７．７１％，磷含量的增加进一步降低了Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ的侵染率，说明磷进一步抑制其侵染。而双接种条件下，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的侵染率都要高于Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ的侵染率，同样处理下Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ侵染率有时仅为Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的５８．６７％，表明混合接种促进了Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ侵染紫云英。

２．６ 不同磷水平和盐水平下接种ＡＭＦ对紫云英生物量的影响

从表１可以看出，在各种处理下，接种ＡＭＦ的紫云英干重要高于未接种的紫云英，说明了ＡＭＦ可以提高紫云英的抗盐性。其中在中磷条件下显示出最佳促生效果，而低磷条件下次之，高磷条件最差。中磷浓度（３０ ｍｇ／ｋｇ）下，在低盐时，Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ促生效果介于Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ和混合接种之间，在高盐条件时单接种Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的促生效果最好，Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ促生效果最差。

３ 小结与讨论

ＴＢ染色观察Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ和Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ这两种ＡＭＦ对紫云英的侵染率和定量ＰＣＲ检测的相关系数分别为０．９８０ ７和 ０．９５１ ３，说明直接用定量ＰＣＲ方法检测ＡＭＦ的侵染率与ＴＢ染色检测的浸染率之间的线性关系良好。定量ＰＣＲ方法检测ＡＭＦ的侵染率可以用来研究不同ＡＭＦ对不同宿主的偏好性、在宿主植物中的分布状态，还可以运用于分子生态学研究中，通过检测土样中ＡＭＦ的ＤＮＡ含量，筛选出抗环境胁迫的高效菌种，可以加大这类ＡＭＦ的利用。本研究利用定量ＰＣＲ方法检测ＡＭＦ的侵染率的研究结果与Ａｌｋａｎ等［１１］的研究结果相似，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ在混合接种中对宿主植物的侵染率最高。而Ｊａｎｓａ等［１４］在运用实时荧光定量ＰＣＲ技术研究Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ，Ｇｌｏｍｕｓ ｃｌａｒｏｉｄｅｕｍ单接种或者混合接种侵染苜蓿时，发现Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ对宿主植物的侵染率最高，说明ＡＭＦ对宿主植物具有一定的偏好性。目前对利用实时荧光定量ＰＣＲ检测不同ＡＭＦ侵染率的可行性还存在争议。

在不同磷浓度下，随着盐浓度的增加，紫云英的生物量都减少，但接种ＡＭＦ的紫云英生物量都要高于未接种的紫云英，表明ＡＭＦ促进了紫云英在盐渍环境中的生长。高磷（６０ ｍｇ／ｋｇ）浓度下，随着盐浓度的增加，菌根紫云英生物量变化不大，可能是紫云英吸收了大量磷减少了对盐的吸收，这与之前利用施加营养元素缓解盐胁迫的结论是一致的［１５］。可能是植物吸收磷抑制了对盐的吸收，植物对盐和磷的吸收存在竞争性关系［１６］。在中磷（３０ ｍｇ／ｋｇ）浓度下，低盐时Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ促生效果介于Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ和混合接种之间；高盐时单接种Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的促生效果最好，Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ促生效果最差，不同的接种方式促生效应不一样，而盐和磷对ＡＭＦ间的相互作用关系也产生影响。

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［１１］ ＡＬＫＡＮ Ｎ， ＧＡＤＫＡＲ Ｖ，ＹＡＲＤＥＮ Ｏ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｗｏ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ， Ｇｌｏｍｕｓ ｍｏｓｓｅａｅ ａｎｄ Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ， ｂｙ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ［Ｊ］． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００６，７２（６）：４１９２．

［１２］ ＧＡＭＰＥＲ Ｈ Ａ， ＹＯＵＮＧ Ｊ Ｐ Ｗ． Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ： Ａｒｅ ｔｈｅ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｕｎｉｔ ｏｆ ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇａｌ ａｂｕｎｄａｎｃｅ？［Ｊ］． Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２００８，４５（５）： ５８１－５９６．

［１３］ ＬＩ Ｙ Ｘ， ＺＨＯＵ Ｌ， ＬＩ Ｙ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｎｏｄｕｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｌａｎｔ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ， ＡｓＮＯＤＦ３２， ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｎｏｄｕｌｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｆｉｘａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ｍａｎｕｒｅ ｌｅｇｕｍｅ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ［Ｊ］． Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ， ２００８，１８０（１）：１８５－１９２．

［１４］ ＪＡＮＳＡ Ｊ， ＳＭＩＴＨ Ｆ Ａ， ＳＭＩＴＨ Ｓ Ｅ． Ａｒｅ ｔｈｅｒｅ ｂｅｎｅｆｉｔｓ ｏｆ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｒｏｏｔ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ？［Ｊ］． Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ，２００８，１７７（３）：７７９－７８９．

［１５］ 段德玉，刘小京，李存桢． Ｎ素营养对ＮａＣｌ胁迫下盐地碱蓬幼苗生长及渗透调节物质变化的影响［Ｊ］．草业学报，２００５，１４（１）：６３－６８．

［１６］ ＰＦＥＩＦＦＥＲ Ｃ Ｍ， ＢＬＯＳＳ Ｈ Ｅ. Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｕａｙｕｌｅ （Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ） ｉｎ ａ ｓａｌｉｎｅ ｓｏｉｌ ａｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｂｙ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ－ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ，１９８８，１０８（３）：３１５－３２１．