新城疫病毒检测方法的研究进展

摘要：新城疫是由新城疫病毒（NDV）引发禽类的烈性、急性、高度接触性疾病，禽类感染NDV后的死亡率可达 100%，国际兽疫局（OIE）将其列为动物A 类疫病。因此，对新城疫病毒进行简便、快速、准确的检测具有重要意义。本文从病毒分离及鉴定、免疫血清学检测、分子生物学检测、量子点技术、荧光微球检测技术方面阐述了NDV检测技术进展，以期为临床和科研工作者提供一定的参考。

关键词：新城疫病毒；检测；进展

中图分类号： S852.65 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2015.19.049

NDV 在全球范围内分布广泛，上百种禽类对 NDV 可以实验室感染或自然感染，同时还有大量的其他种类动物疑似被感染[1]。在1926 年新城疫首次在印度尼西亚的 Java[2]和英国的新城[3]暴发。90年代后，该病在亚洲多个国家发生，给禽类养殖业带来了巨大损失。因此，世界各国十分重视该病的发生和流行，NDV快速而准确的检测具有重要意义。目前用于检测NDV的技术手段种类繁多，现主要介绍以下几种：

1病毒的分离鉴定

该方法诊断疫病确切，同时可定性感染的毒株。通过将病毒接种SPF鸡胚的方法进行分离，应用血液凝集试验和血液凝集抑制试验对病毒进行鉴定。该试验方法的准确性和敏感性高，重复性好，特异性强，但其存在高成本、长时间等不足之处，所以不适合该病的快速诊断。

2血清学技术

2.1酶联免疫吸附试验（ELISA）

酶联免疫吸附试验是通过物理方法将抗原或抗体吸附在固相载体上，然后测定免疫酶。该方法是目前研究最多最广泛的一门技术方法，其优点主要是程序自动化，可快速获取结果，花费少。卢建红[4] 、吴长新[5]、陈昌海[6]、吴红专[7]、蒋凤英[8]等建立了多种ELISA方法对新城疫病毒的检测。研究结果显示了该项技术高度的特异性和敏感性、安全、便捷、快速。

2.2 免疫荧光抗体技术

该方法是将荧光素如异硫氰酸（FITC）标记抗体，然后用荧光显微镜观察荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法[9]。该种方法具有快速、准确、简单的特点。刘建宏[10]等用荧光标记的单克隆抗体对病例鸡的NDV抗原进行检测，实验结果表明免疫荧光技术的准确、快速。

2.3免疫胶体金电镜技术

该方法是一种新型的免疫标记技术，以胶体金为标志物应用到抗原抗体。标记物制备简便，方法特异、敏感，无放射性同位素、酶显色底物，不需要荧光显微镜，其应用前景广泛。薛拥志[11]等应用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒标记NDV抗体，用直接电镜、免疫电镜和胶体金免疫电镜技术比较观察新城疫病毒。实验证明胶体金电镜技术作为检测NDV的检测方法具有简单、准确和快速等优点。

3分子生物学技术

3.1荧光定量RT-PCR 技术

荧光定量RT-PCR 技术检测新城疫病毒的方法应用的是 TaqMan 技术[12]，通过荧光标记的特异性探针来标记跟踪PCR产物。其方法比常规的检测方法用时少、周期短、灵敏、准确、特异性强、操作简便等。屈素洁[13]等通过构建重组阳性标准质粒的方法，建立检测NDV核酸的荧光定量PCR方法，其实验方法实现了对新城疫的定量检测。

3.2基因芯片技术

基因芯片技术是近年来基于分子生物学技术发展起来的一种检测技术，该方法是将大量的探针分子固定到固相支持物上，借助核酸分子杂交配对的特性对DNA样品的序列信息进行高效的解读和分析。耿捷[14]等根据新城疫病毒基因序列设计了30条寡核苷酸探针芯片，通过对NDV的检测说明芯片的稳定性、特异性和敏感性较好，成本低廉，方法简单。为新城疫的检测提供了新方法，适合新城疫病毒的快速检测。

4量子点检测技术

量子点是最近几年发展起来的一种新型荧光材料，具有稳定性、生物相容性好等特点，目前已成为病原检测的新型工具。房保海[15]等应用量子点建立了检测新城疫病毒的新方法，以生物素标记的抗NDV单克隆抗体为检测抗体，NDV的多克隆抗体为捕捉抗体，量子点标记的链霉亲和素为荧光探针。试验结果表明，该方法与其他禽类疫病无交叉反应，试验灵敏，为临床早期快速检测NDV提供了新手段。

5免疫荧光微球技术

荧光微球是指直径在纳米至微米级范围内，负载有荧光物质，受外界能量刺激时能激发出荧光的一种固体颗粒[16]。将荧光微球与流式细胞术相结合，形成一种新型的分析检测系统。应用一种激光光源激发出三种不同的波长，当三种波长同时被检测出来时，就可确定其中一种相应的被检测物质的存在。其优点是灵敏度高、特异性强、分析速度快，仅微量样品就可进行多组分同时分析[17]。笔者应用荧光微球技术实现了对新城疫病毒和禽流感病毒的快速检测[18-19]。该方法的特异性、敏感性和重复性较好。

近年来，随着新城疫疫情的发生发展，更加便捷、快速、高通量的检测方法一定会被研制出来，为动物疫情的控制与消灭提供强大的科学技术手段。

参考文献

[1] Alexander， D.J. Newcastle disease and other paramy

xoviridae infections[A]. Calnek， B.W. （Ed.） Diseases of Poultry[C].10th Ed. Mosby-Wolfe， London， pp. 1997：541-569.

[2]Kraneveld，F.C.A poultry disease in the Dutch East

Indies[J].Ned Indisch BI Diergeneesk，1926（38）：448-450.

[3]Doyle，T.M.A hitherto uecorded disease of fowls

due to a filter-passing virus[J].JComp Pathol Ther， 1927（40）：144-169.

[4] 卢建红，张如宽，焦新安，等.抗新城疫病毒单抗夹心PEG-ELISA建立及其初步应用[J].中国兽医科技，1994，24（03）：1-3.

[5] 吴长新，张之友，徐福亮，等.应用新城疫诊断试剂盒快速诊断非典型鸡新城疫的研究[J].江苏农学学报，1997，18（01）：6-8.

[6] 陈昌海，张如宽，刘秀梵.用单抗夹心ELISA自免疫鸡群检测新城疫强度[J].中国畜禽传染病，1993（04）：28-31.

[7] 吴红专，张如宽，刘秀梵.新城疫单抗ELISA试剂盒的研制及其初步应用[J].中国兽医科技，1995，25（06）：3-6.

[8]蒋凤英，胡建华，倪建平，等.单抗夹心ELISA检测免疫鸡群新城疫病毒[J].上海交通大学学报，2004，22（03）：286-287.

[9]刘宇，徐春志，岳筠，等.新城疫病毒检测技术研究进展[J].畜牧兽医科学信息，2007，（08）.

[10]刘建宏，王标，庄向生.单克隆抗体检测新城疫病毒[J].江苏农学院学报，1990，（18）.

[11]薛拥志，孙继国，甘永华，等.用胶体金免疫电镜技术检测新城疫病毒[J].河北农业大学学报，2003（26）：20-22.

[12] Aldous EW， Collins MS， McGoldrick A .etal. Rapid

pathotyping of Newcastle disease virus （NDV） using fluorogenic probes in a PCR assay[J].Vet Microbiol，2001，80（03）.

[13] 屈素洁，梁媛，韦显凯，等.荧光定量RT-PCR检测鸡新城疫病毒方法的建立及应用[J].上海畜牧兽医通讯，2014（03）：19-21.

[14] 耿捷，罗卫，林苗，等.基因芯片技术检测新城疫病毒[J].黑龙江畜牧兽医，2004（12）：72-73.

[15] 房保海，孙涛，贾俊涛，等. 基于量子点标记技术的鸡新城疫病毒sFLISA检测技术研究[J]. 山东农业科学，2014，46（05）：118-121.

[16] 汪地强，刘白玲，胡杰，等. 荧光微球的制备及应用[J].高分子材料科学与工程，2004，20（04）：41-45.

[17] Lizard G.， Monier S.， Prunet C.， Duvillard L.， Gambert P.. Annales De Biologie Clinique， 2004（62）： 47-52.

[18]杨丽丽，王振国，王明泰，等.新城疫病毒流式微球免疫检测新方法[J].分析化学，2008，1（36）：29-33.

[19]杨丽丽，王晓娥，李占东.应用荧光微球检测禽流感病毒的初步研究[J].天津农业科学，2015，21（08）：31-33.

作者简介：杨丽丽，硕士，吉林工程技术师范学院食品工程学院，讲师，研究方向：食品微生物检测。