猪源嗜性衣原体HB1043株主要外膜蛋白（MOMP）基因的分析及重组表达

摘要：根据GenBank中衣原体主要外膜蛋白（MOMP）全基因序列设计特异性引物，以临床分离的衣原体病原中提取的衣原体全基因组为模板，利用特异性引物PCR扩增得到MOMP全基因序列。通过BLAST比对，结果显示其与已提交的猪流产衣原体CG1株的MOMP序列（EU531729）有1个碱基不同。根据对测序结果进行信号肽序列预测及内切酶位点分析，选用BamHⅠ和SalⅠ双酶切将目的蛋白序列克隆到表达载体pET-28a上，得到重组质粒pET-28a-MOMP。将重组质粒转化入E. coli BL21进行表达，表达产物使用镍离子亲和层析柱进行纯化得到目的蛋白rMOMP。目的蛋白经Western-blot检测，证明其具有免疫学活性。

关键词：猪流产嗜性衣原体；主要外膜蛋白（MOMP）；重组表达

中图分类号：S852.67 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）04-0949-04

Cloning and Expression of Major Outer Membrane Protein of Chlamydophila Clinical Strain HB1043 from Swine

YAN Shao-xia1，2，TIAN Yong-xiang1，LIU Ze-wen1，YUAN Fang-yan1，GUO Rui1，DUAN Zheng-ying1，

YANG Ke-li1，MENG li1，ZHOU Dan-na1，LI Shao-wen2

（1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064，China； 2. College of Animal Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070，China）

Abstract： Chlamydophila was an obligate intracecullar parasites and could infect human and multiple animals. According to the published complete nucleotide sequence of Chlamydophila major outer membrane protein （MOMP） in the GenBank and the whole genome of Chlamydophila isolated from clinical samples， the whole genome sequence of MOMP gene were obtained by PCR. The PCR product was sequenced and blasted with the committed MOMP sequence （EU531729） from strain CG1 of swine Chiamydophila abortus. The results showed that it had one base different from the CG1 strain. The extinction enzymes sites BamHⅠand SalⅠwere selected for cloning the MOMP sequence to the pET-28a. The restructuring plasmid pET-28α-MOMP were then transfered into E. coli BL21 and expressed. The target protein rMOMP was purified by the Ni Sepharose 6 Fast Flow and proved with immunocompetence by Western-blot.

Key words： Chlamydophila； major outer membrane protein； recombined expression

衣原体是一类细胞内专性寄生的、大小介于细菌和病毒之间的革兰氏阴性微生物。衣原体感染在世界范围内均有流行，是一种能够引起人和动物患病的人畜共患病原体。依据衣原体核糖体rRNA的序列比对以及多态性限制性酶切位点的分析，将衣原体科分为衣原体属和嗜性衣原体属。

嗜性衣原体属包含鹦鹉热嗜性衣原体、流产嗜性衣原体、肺炎嗜性衣原体、家畜嗜性衣原体、猫嗜性衣原体以及豚鼠嗜性衣原体[1]。其中，危害最大的病原体主要是流产嗜性衣原体和鹦鹉热嗜性衣原体。流产嗜性衣原体是从鹦鹉热嗜性衣原体中衍生出来的一个新成员，这两种病原体都可以感染猪、绵羊、山羊、牛等哺乳动物，同时作为一种人畜共患的病原体，经常与感染动物接触的人可经呼吸道传播的途径发生感染。人类感染后主要表现为类似流感的病症，严重时可引起心内膜炎、脑炎、肺炎、流产甚至死亡[2]。

近些年来，研究者对衣原体的基因组学以及蛋白质组学进行了深入的研究，但是针对衣原体病的诊断目前尚没有十分成功的试剂盒得以推广应用。根据以往的研究报道，作为研究热点的诊断抗原蛋白有主要外膜蛋白（MOMP）、多型性外膜蛋白（POMPs）、热休克蛋白（HSP）以及脂多糖（LPS）等。其中40 ku的衣原体MOMP占衣原体外膜蛋白的60%以上，具有血清型、亚种、种和属特异性抗原决定簇，是衣原体病诊断的主要研究抗原[3]。有研究者对流产嗜性衣原体的CP/12株的MOMP、E型沙眼衣原体的MOMP以及鸡源鹦鹉热衣原体的MOMP全长基因进行了克隆表达[4-6]。

本试验所用的病原为临床分离病原，是经特异性引物进行PCR鉴定后的衣原体。经鸡胚攻毒试验证明其具有很强的致死性，致死的鸡胚病理变化与以往研究报道相符。同时，实验室对该病原体的16 S/23 S/16-23 S rRNA进行扩增并经分析鉴定其属于嗜性衣原体属。在系统进化树中，其与鹦鹉热嗜性衣原体和流产嗜性衣原体亲缘关系较近，共用一个节点，但不与鹦鹉热嗜性衣原体和流产嗜性衣原体共枝[7]。鉴于该株嗜性衣原体具有很强的致病致死性，本试验对其主要外膜蛋白进行选择性原核表达，并验证其免疫学活性，以期为下一步开发猪的衣原体病诊断试剂盒打下理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

猪源衣原体HB1043株表达载体pET-28a、感受态细胞Escherichia coli DH5α、E. coli BL21由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所兽医室保存；限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ、T4 DNA连接酶、DNA Marker以及PCR反应试剂等均购自宝生物工程（大连）有限公司；HRP标记的羊抗猪购自SoutherBiotech；猪衣原体阳性血清为本室衣原体IHA试剂盒（购自湖北省畜牧兽医局）检测呈阳性的猪血清；AxyPrep凝胶回收试剂盒购自杭州爱思进生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计 根据GenBank中MOMP全基因序列设计特异性引物上游P1：TTAGGATCCATGAA

AAAACTCTTGAAATCG，前加酶切位点BamHⅠ；下游P2：GCGGTCGACTTAGAATCTGAATTGAGC，前加酶切位点SalⅠ。引物由生工生物工程（上海）技术服务有限公司合成。

1.2.2 目的基因扩增 使用Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒（Bioer Technology co. Ltd，BSC12S1）提取衣原体基因组。取适量临床分离株接毒致死的鸡胚卵黄囊液于1.5 mL离心管中，3 000 r/min离心10 min，取上清液，再15 000 r/min离心30 min，弃上清液，按照试剂盒操作步骤提取基因组。以提取的衣原体全基因组DNA为模板，特异性的引物P1、P2为引物进行PCR反应，反应程序为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。采用AxyPrep凝胶回收试剂盒（杭州爱思进生物技术有限公司，AP-GX-50）对PCR产物进行回收，测序。

1.2.3 MOMP基因序列及蛋白特性分析 使用DNAStar、SignalP 3.0 Server等软件对测序结果进行分析，并与GenBank中衣原体的MOMP序列进行同源性分析。

1.2.4 构建重组质粒pET-28a-MOMP 根据分析结果，选用BamHⅠ和SalⅠ对PCR产物及质粒pET-28a进行双酶切。经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用DNA Fragment Purification Kit ver.2.0（宝生物工程（大连）有限公司，DV807A）对酶切产物进行回收。

将带有黏性末端的酶切产物使用T4 DNA连接酶反应体系连接。连接产物转化感受态细胞E.coli DH5α，转化方法按常规转化步骤进行。筛选出阳性克隆后小量摇菌，使用E.Z.N.A.Plasmid Midi Kit Ⅰ（Omega Bio-Tek，D6944-01）试剂盒提取质粒。提取的质粒经PCR及酶切鉴定，以确定目的片段正确克隆入载体，重组载体命名为pET-28a-MOMP。

1.2.5 重组质粒的转化 上一步中构建好的重组质粒pET-28a-MOMP转化表达载体E. coli BL21。按常规转化方法进行。

1.2.6 诱导表达 将上一步中转化成功的表达菌E. coli BL21接种LB培养基进行诱导表达，同时设置对照组：含空质粒pET-28a的E. coli BL21组。具体操作见文献[8]。

采用SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，AR0138）检测蛋白质表达情况。诱导表达过程中所取的样品均按照常规方法处理。按试剂盒使用说明配胶，上样各20 μL，同时加Protein Marker。80 V，40 min后120 V至电泳完成。电泳完毕后进行考马斯亮蓝染色，观察蛋白表达情况。

1.2.7 rMOMP纯化 重新诱导表达重组蛋白rMOMP。具体操作见文献[8]。

使用Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和层析柱除去杂蛋白。具体步骤按使用说明书进行。最后洗脱时采用咪唑浓度梯度洗脱，咪唑浓度分别为100、200、300 mmol/L的洗脱液洗脱目的蛋白；洗脱完成后加复性剂使重组蛋白复性；最后使用蔗糖浓缩蛋白液浓缩；收集蛋白，1.5 mL离心管分装，-70 ℃保存。其中每个步骤取样待检。

SDS-PAGE电泳检测蛋白表达及纯化情况，拍照。

1.2.8 rMOMP活性检测 重新诱导表达，SDS-PAGE电泳结束后切胶进行Western-blot检测其免疫学活性，同时做阴性对照，具体操作见文献[8]。其中阳性组和阴性组所用一抗为经IHA试剂盒检测确定的阳性血清及阴性血清。观察结果并拍照。

2 结果与分析

2.1 测序结果及分析

使用DNAStar对MOMP测序结果分析显示，扩增得到的MOMP序列全长为1 176 bp，编码的蛋白质为391个氨基酸，分子质量约为42.4 ku。由Protean软件分析其表面抗原位点如图1所示。从图中可看出第20-90位氨基酸残基之间的区段虽然抗原性位点较强但是其可能不是表面抗原位点，而在100位、240位以及345位氨基酸残基处抗原性较强，而且均可能为表面抗原位点。

测序结果经BLAST比对显示，扩增的MOMP与GenBank中流产嗜性衣原体CG1株的MOMP全序列（EU531729）有1个碱基不同，而且此位点突变后CG1株中原有的限制性内切酶位点MsⅡ消失；与鹦鹉热嗜性衣原体C1/97株以及GD株有3个碱基位点不同。

SignalP 3.0 Server分析结果如图2，全部391个氨基酸残基中最有可能为信号肽的是前22个氨基酸残基。

对序列进行限制性酶切位点分析，在271 bp处为限制性内切酶BamHⅠ位点，而且经此酶切位点切割后后续碱基序列的读码框并未受到影响。结合前面的分析结果，将此限制性内切酶位点前的序列切除，对后面部分进行选择性表达。

2.2 PCR产物电泳结果

以提取的衣原体全基因组为模板，特异性引物P1、P2为引物PCR扩增目的蛋白MOMP的全基因片段，其产物进行琼脂糖凝胶电泳如图3所示。从图中可以清晰地找到目的条带，大小在1 200 bp左右，与预期大小相符，说明PCR得到了MOMP的全基因片段。

2.3 SDS-PAGE检测结果

蛋白纯化过程中收集的各阶段样品进行SDS-PAGE电泳检测结果如图4。由图4可知，含有空载体pET-28a的BL21组在诱导前后的蛋白表达情况基本上没有不同，只是蛋白量的多少不同；而含有pET-28a-MOMP重组载体的BL21组在经加入诱导剂IPTG后在42.4 ku大小处可以明显观察到有新的蛋白产生，其大小与目的蛋白rMOMP的预测大小一致，说明目的蛋白得到很好的表达；菌体经超声破碎后的上清中没有目的蛋白，说明目的蛋白是以包涵体沉淀的形式存在的；3个不同咪唑浓度的洗脱液电泳结果说明咪唑浓度在100 mmol/L时为最佳的洗脱条件；浓缩后的蛋白样品电泳结果说明经过纯化，蛋白溶液中的杂蛋白基本上被除去。

2.4 rMOMP活性检测结果

对纯化得到的rMOMP进行Western-blot试验，结果如图5。由图5可知，rMOMP与猪衣原体的阳性血清发生了反应，而与阴性血清不反应，说明得到的蛋白具有免疫学活性。

3 小结与讨论

衣原体的外膜结构与其他革兰氏阴性菌不同，其缺乏肽聚糖成分，由脂多糖代替。整个分子的稳定性由40 ku的主要外膜蛋白（MOMP）、富含半胱氨酸的60 ku的大蛋白和12 ku的小蛋白通过广泛的二硫键结合形成网络状来维持。分子生物学研究表明MOMP是一种膜孔类蛋白，其结构类似于大肠杆菌的OmpF和PhoE通过疏水性和静电力结合形成的三聚体。MOMP的这个三聚体结构是由3个MOMP单体构成，在单体内部及单体之间存在广泛的二硫键[9]。Rodriguez-Maranon构建的MOMP分子模型中，MOMP单体是由16个反向平行的β-卷曲形成的圆桶状的分子通道结构。MOMP的4个VD区则位于桶状结构的外表面，与EB的黏附及进入真核细胞有直接的关系[10]。许多研究资料均表明，MOMP具有很强的抗原活性而且是制备衣原体疫苗最佳的候选单位[11，12]。

信号肽在蛋白外源表达过程中对蛋白的产率、降解以及产物加工复性等都有很大的影响[13]。该试验对临床分离的衣原体MOMP全基因片段进行了扩增、测序以及序列分析。分析结果显示，此株衣原体与已报道的CG1株流产嗜性衣原体的MOMP序列有一个碱基突变，而该位点突变后，CG1株中原有的限制性内切酶位点MsⅡ消失，关于该酶切位点的有无对MOMP性质的影响有待进一步研究分析。同时根据序列分析结果将限制性内切酶位点BamHⅠ之前部分序列切除后进行了诱导表达。表达产物经纯化后通过Western Blot检测其免疫学活性，结果证明试验中所得到的蛋白仍然具有免疫学活性。关于该株衣原体的MOMP可否作为诊断抗原并进一步开发猪衣原体病的检测试剂盒等问题将在后续试验中加以论证。同时该试验结果也为衣原体基因工程疫苗的研究提供了理论参考。

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