1，25—（OH）2—D3对单侧输尿管梗阻大鼠肾小管间质巨噬细胞趋化抑制因子及核转录因子κB/P65表达的影响

[摘要] 目的 观察巨噬细胞趋化抑制因子（MIF）及核转录因子κB/P65（NF-κB/P65）在单侧输尿管梗阻大鼠肾小管间质中的表达及1，25-（OH）2-D3对其的影响。 方法 采用单侧输尿管结扎手术建立单侧输尿管梗阻模型。将健康成年的雄性SD大鼠按随机数字表法分为3组：假手术组（n=10）、模型组（n=10）和VD组（n=10）。VD组采用6 ng/（100 g·d）的1，25-（OH）2-D3干预治疗，假手术组和模型组仅给予等量生理盐水灌胃8周。观察3组大鼠第8周肾功能、肾组织病理学改变，免疫组化法检测单核/巨噬细胞表面特异性标志抗原（ED-1）、NF-κB/P65、MIF在肾组织中的表达。 结果 与假手术组相比，模型组血肌酐增高（P<0.01），肾间质面积/统计场面积增加（P<0.01），肾组织ED-1阳性细胞明显增加（P<0.01），肾组织MIF的表达显著升高（P<0.01），NF-κB/P65核阳性细胞明显增加（P<0.01）。与模型组比较，VD组大鼠肾组织病理学变化得到一定程度的改善，肾组织ED-1、MIF的表达及NF-κB/P65核阳性细胞明显减少（P<0.01）。 结论 单侧输尿管梗阻大鼠肾间质MIF的表达和NF-κB/P65的活性明显增加，1，25-（OH）2-D3可能通过下调MIF的表达，抑制NF-κB/P65的活性来减轻肾小管间质的炎症反应，改善肾脏纤维化。

[关键词] 1，25-（OH）2-D3；巨噬细胞趋化抑制因子；核转录因子κB/P65；肾小管间质炎症反应

[中图分类号] R692.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）09（b）-0008-05

Effects of 1，25-dihydroxyvitamin D3 on the expression of macrophage chemotaxis inhibitory factor and nuclear factor-κB/P65 of tubulointerstitial cells in unilateral ureteral ligation operation model rats

LONG Yan-jun1 YANG Xiao-cui2★ YANG Xia1 DA Jing-jing1 YUAN Jing1 TIAN Mao-lu1 ZHA Yan1▲

1.Department of Nephrology，People′s Hospital of Guizhou Province，Guiyang 550002，China；2.The Fourth People′s Hospital of Zunyi City in Guizhou Province，Zunyi 563000，China

[Abstract] Objective To investigate the expression of macrophage migration inhibitory factor（MIF）and nuclear factor-κB/P65（NF-κB/P65）in the kidneys of unilateral ureteral obstruction（UUO）model rats and the effect of 1，25-dihydroxyvitamin D3 on the xpression. Methods Thirty healthy adult male SD rats were randomly divided into 3 groups：sham operation group（n=10），model group（n=10）and VD group[n=10，UUO rats treated with 6 ng/（100 g·d） 1，25-dihydroxyvitamin D3].The rats in sham group and model group were treated with equal normal saline by lavage for 8 weeks.Serum creatinine，histopatho1ogical change，renal tubulointerstitial macrophage marker antigen（ED-1），NF-κB/P65 and MIF in rats at 8 weeks was measured by immunohistochemistry respectively. Results Serum creatinine，renal interstitial area/statistical field area，the expression of MIF，the amount of NF-κB/P65 nuclear positive cell and ED-1 positive cell in model group was significantly increased compared with that in sham group respectively（P<0.01）. Compared with model group，rat renal histopathological change in VD group had a certain degree of improvement，the expression of MIF，the amount of NF-κB/P65 nuclear positive cell and ED-1 positive cell in VD group was significantly decreased respectively（P<0.01）. Conclusion The expression of MIF and the activition of NF-κB/P65 in UUO rats increase significantly.1，25-dihydroxyvitamin D3 may ameliorate the progression of renal tubulointerstitial inflammation and renal fibrosis by intervene the expression of MIF and decrease the activition of NF-κB/P65.

[Key words] 1，25-dihydroxyvitamin D3；Macrophage chemotaxis inhibitory factor；Nuclear factor-κB/P65；Renal tubulointerstitial inflammation

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）正成为一个全球范围内的公共卫生问题[1]。肾小管间质炎症可促进CKD患者肾脏纤维化的进程，导致终末期肾衰竭。巨噬细胞移动抑制因子（MIF）是一种强有力的炎症前细胞因子[2]，可引起核转录因子-κB（NF-κB）的活化。在鼠的抗肾小球基底膜肾炎、系膜增生性肾炎、MRL/lpr狼疮性肾炎等均发现MIF表达增加[3]，与肾脏组织学损害（间质纤维化等）、蛋白尿程度及肾功能衰退密切相关[4-5]。本研究在单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）大鼠模型中观察肾小管间质炎症反应和肾小管间质细胞MIF、NF-κB的表达情况及给予1，25-（OH）2-D3干预后MIF、NF-κB在肾小管间质细胞中表达的变化，探讨1，25-（OH）2-D3是否通过MIF影响NF-κB活性来改善肾小管间质的炎症反应，为肾纤维化药物治疗提供更广泛的循证医学依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

6周左右雄性SD大鼠30只，体重170～220 g，许可合格证号scxk（渝）2007-0005，由重庆试验动物中心提供。按随机数字表法分为假手术组（n=10）、模型组（n=10，行单侧输尿管结扎手术）和1，25-（OH）2-D3干预组（VD组）（n=10，行单侧输尿管结扎手术加1，25-（OH）2-D3 6 ng/（100 g·d）入饮水中灌胃8周）。假手术组和模型组予等量生理盐水灌胃。

1.2 动物处理

在UUO术后8周麻醉大鼠从颈总动脉采血，4℃、3000 r/min离心15 min分离血清，用于测定血肌酐。脱髓处死所有大鼠，剖取左侧肾脏，剥离包膜，部分肾组织10%中性甲醛溶液固定，行组织病理学、免疫组织化学检测，部分肾组织存放于-80℃，行Real-time PCR和Western blot检测。

1.3 组织病理学检测

石蜡切片行常规HE、PAS和Masson染色，光镜下双盲法观察肾小管间质的变化情况。每只大鼠选取3张切片，每张切片随机选取10个肾小管间质视野（避开肾小球和大血管），肾间质面积测量在200倍光镜下，每个视野分别测量肾间质面积与统计场面积的比值。采用显微图像分析系统（Olympus C3040.ADU）对各组染色结果进行积分吸光度（A）测定，每张切片随机选取10个高倍视野（200倍），每个视野代表0.13 mm2的区域面积，计算其A值，取平均值。

1.4 免疫组织化学检测

切片脱蜡复水；抗原修复采用微波热修复，室温冷却；经3%双氧水封闭内源性酶；正常羊血清封闭15～20 min；加入一抗ED-1（Santa Cruz）1∶50、NF-κB/P65（Cell Signaling Technology）1∶400、MIF（Santa Cruz）1∶50，4℃孵育过夜；滴加HRP Polymer（酶标二抗），在室温下孵育30 min；DAB显色，苏木素复染，脱水，透明。实验同时以磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照。

1.5 统计学处理

采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以x±s表示，采用单因素方差分析或q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠血肌酐及肾间质面积/统计场面积的比较

术后8周，模型组的血肌酐及肾间质面积/统计场面积明显高于假手术组及VD组（P<0.01）；VD组的血肌酐及肾间质面积/统计场面积明显高于假手术组（P<0.01）（表1）。

表1 3组大鼠血肌酐及肾间质面积/统计场面积的比较（x±s，n=10）

与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01

2.2 3组大鼠肾组织病理检查结果

假手术组肾小管间质形态正常；模型组可见肾小管管腔增大，小管上皮细胞空泡状变性、萎缩、脱落，肾间质结构紊乱、炎症细胞浸润及纤维化；VD组肾小管间质病变较模型组明显改善（图1）。

2.3 3组大鼠肾小管间质ED-1的表达情况

免疫组化显示假手术组ED-1表达极少；与假手术组比较，模型组ED-1表达明显升高（P<0.01），主要表达于肾小管上皮细胞及肾间质细胞的细胞质中；与模型组比较，VD组ED-1表达明显减少（P<0.01）（图2）。

图2 3组大鼠肾小管间质ED-1的表达情况（×200）

A.假手术组；B.模型组；C.VD组；与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01

2.4 3组大鼠肾小管间质MIF的表达情况

免疫组化显示假手术组MIF表达极少；与假手术组比较，模型组MIF明显升高（P<0.01），主要表达于肾小管上皮细胞及肾间质细胞的细胞质中；与模型组比较，VD组MIF表达明显减少（P<0.01）（图3）。

2.5 3组大鼠肾小管间质NF-κB/P65的表达情况

免疫组化显示假手术组NF-κB/P65在肾小管上皮细胞中主要表达于细胞质，未见明显核阳性细胞；模型组肾小管NF-κB/P65核阳性细胞较假手术组明显升高（P<0.01）；VD组肾小管NF-κB/P65核阳性细胞明显减少（P<0.01）（图4）。

3 讨论

肾脏纤维化，尤其是肾小管间质纤维化，几乎是所有CKD的最终结果[6]。肾小管间质炎症是肾小管间质纤维化的重用病理生理机制之一。MIF是免疫和炎症反应中的关键成分[2]，是一种含有115个氨基酸的蛋白质，相对分子质量约为12.5 kD[7]。MIF的活化状态是由含2个反向平行α螺旋和6个β片层的三个单体组成的同源三聚体，形成一末端开放的中空结构。MIF主要由巨噬细胞产生，其他细胞如淋巴细胞、树突状细胞、中性粒细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、成纤维细胞、心肌细胞、神经细胞、生殖组织、脂肪细胞和激素分泌细胞也可表达MIF[8]。MIF主要通过抑制巨噬细胞游走移动，促进巨噬细胞在炎症局部的聚集、增生及分泌多种细胞因子如白介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等发挥其增强炎症反应程度的生物学效应。在正常人、大鼠的肾组织中，MIF主要在肾小球脏层和壁层上皮细胞表达，在肾小管上皮细胞弱表达[9]。在人类各种原发和继发肾小球疾病中，肾脏MIF表达均增加[3]。有研究发现，在系统性红斑狼疮小鼠模型中给予MIF拮抗剂处理可改善肾脏的功能及组织学指标[10]。本研究发现，UUO大鼠肾小管间质ED-1阳性细胞明显升高，MIF的表达明显增加，结果提示MIF可能参与UUO大鼠肾小管间质的炎症反应，与既往在进展性肾炎模型大鼠上的相关研究一致[11]。

NF-κB属于NF-κB/Rel家族，由NF-κB1（p50/p105）、NF-κB2（p52/p100）、RelA（p65）、RelB及c-Rel五个成员组成，是调控诸多基因的重要转录因子，参与炎症反应、免疫应答、细胞增生及转化和凋亡等重要的生理病理过程[12-13]。许多与肾脏损伤相关的刺激（如高糖、蛋白尿、糖基化终产物等）均可引起NF-κB的活化[14-15]，其中起主要作用的是NF-κB1/P65异源二聚体。有研究发现，MIF可以通过作用于一种转录因子ETS家族成员PU1来上调TCL-R4的表达，引起NF-κB过度激活，导致炎症反应的级联放大效应[16-17]。另有研究发现，MIF在IgA大鼠肾损伤中的作用机制可能与活化NF-κB/P65有关[18]。本研究发现，在正常大鼠肾小管间质中NF-κB/P65核阳性细胞极少，而在UUO大鼠肾小管间质的NF-κB/P65核阳性细胞明显增加，结果提示在UUO大鼠中，MIF可能通过诱导NF-κB/P65活化，参与肾小管间质炎症反应。

研究发现，1，25-（OH）2-D3通过减轻梗阻性肾病模型中肾小球硬化的损伤而发挥抗肾脏纤维化的作用[19]，已被证实可以延缓肾小球硬化及肾间质纤维化的进展[20]，但具体机制尚不明确。本研究发现，在UUO大鼠肾脏，MIF表达明显升高（P<0.01），且ED-1、NF-κB/P65核阳性细胞增加；应用1，25-（OH）2-D3处理降低了MIF在UUO模型大鼠肾脏中的表达和聚集，减少了NF-κB/P65、ED-1核阳性细胞数量，明显减轻了肾小管间质病变，改善了肾功能。

本研究结果证实，应用1，25-（OH）2-D3干预可减轻UUO大鼠肾小管间质的炎症反应，缓解肾小管间质纤维化。1，25-（OH）2-D3可能通过抑制MIF在肾小管间质的表达，减少NF-κB/P65的活化，改善炎症反应，减轻肾脏损伤。

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（收稿日期：2014-08-01 本文编辑：李亚聪）