多囊卵巢综合征卵巢颗粒细胞凋亡调控蛋白Bcl-2、Bax、p53的表达及其意义

【摘要】 目的 探討多囊卵巢综合征（PCOS） 卵巢颗粒细胞凋亡基因Bcl-2、Bax、p53的表达及意义。方法 选择35例行腹腔镜下双侧卵巢打孔术的PCOS患者（PCOS组），另选择同期30例行腹腔镜妇科手术的非PCOS患者（对照组），收集术中取得的卵巢组织，通过免疫组织化学染色法检测2组卵巢颗粒细胞凋亡调控蛋白Bcl-2、Bax、p53分布与表达，计算组织学积分，比较PCOS患者术前及术后的卵泡刺激素、黄体生成素（LH）、雌二醇、睾酮水平，PCOS组患者术后规律服用二甲双胍1 500 mg/d，对其进行为期1年的随访，对比Bax阳性与Bax阴性患者的1年临床妊娠率差异。结果 PCOS组患者的术后LH、睾酮均低于术前（P均< 0.05）。PCOS组的Bax阳性颗粒细胞主要见于囊性卵泡壁，对照组Bax阳性颗粒细胞较少，散在分布于卵巢上皮间质。2组的Bcl-2阳性颗粒细胞数量均较少。PCOS组的p53阳性细胞主要散在分布于小卵泡壁，对照组的p53阳性细胞多为散在分布。PCOS组的Bax及p53蛋白的组织学积分均高于对照组（P均< 0.05），2组Bcl-2蛋白的组织学积分比较差异无统计学意义（P > 0.05）。35例PCOS患者中，Bax阳性28例、阴性7例，术后随访1年，Bax阳性者的1年临床妊娠率高于Bax阴性者（P < 0.05）。结论 凋亡调控蛋白Bax、p53可能参与PCOS患者卵巢颗粒细胞的凋亡。

【关键词】 细胞凋亡;多囊卵巢综合征;腹腔镜手术;妊娠

Expression and significance of apoptosis regulatory proteins Bcl-2， Bax and p53 in ovarian granulosa cells of patients with polycystic ovary syndrome Wu Jian， Zheng Baotang， Zhang Lin， Tang Zhongqing， Wang Lan， Su Shenghong， Chen Yan. Department of Gynecology， Wuzhou Workers’ Hospital， the Seventh Affili-ated Hospital of Guangxi Medical University，Wuzhou 543001， China

Corresponding author， Wu Jian， E-mail： wjnzc0625@ 126. com

【Abstract】 Objective To investigate the expression and significance of apoptosis regulatory proteins Bcl-2， Bax and p53 in the ovarian granulosa cells of women with polycystic ovary syndrome （PCOS）.  Methods Thirty-five PCOS patients undergoing laparoscopic bilateral ovarian drilling （PCOS group） and 30 non-PCOS patients who underwent laparoscopic gynecologic surgery （control group） were recruited in this investigation. Ovarian tissues were collected during the operation. The distribution pattern and expression level of apoptosis regulatory proteins Bcl-2， Bax and p53 in the ovarian granulosa cells were detected by immunohistochemical staining in two groups， and the histological grading scores were calculated. The levels of follicle stimulating hormone， luteinizing hormone （LH）， estradiol and tesosterone of PCOS patients were quantitatively measured and compared before and after operation. Patients in the PCOS group were given with metformin at a dose of 1 500 mg/d postoperatively and followed up for 1 year. The 1-year clinical pregnancy rate was statistically compared between patients with positive and negative Bax. Results The postoperative LH and testosterone levels in the PCOS group were significantly lower than those before operation （both P < 0.05）. In the PCOS group， the Bax-positive granulosa cells were mainly distributed in the cystic follicular wall， whereas the quantity of Bax-positive granulosa cells was small and scattered in the ovarian epithelial stroma in the control group. The number of granulosa cells with positive Bcl-2 was small in both groups. In the PCOS group， p53-positive granulosa cells were mainly scattered in the wall of small follicles， whereas those in the control group were scattered. The histological grading scores of Bax and p53 proteins in the PCOS group were significantly higher than those in the control group （both P < 0.05）， whereas the histological score of Bcl-2 protein did not significantly differ between two groups （P > 0.05）. Among 35 PCOS patients， Bax was positive in 28 cases and negative in 7 cases. During 1-year follow-up， the 1-year clinical pregnancy rate of Bax-positive patients was significantly higher compared with that of those with negative Bax （P < 0.05）.  Conclusion Bax is probably involved in the apoptosis of ovarian granulosa cells in PCOS patients.

【Key words】 Cell apoptosis;Polycystic ovary syndrome;Laparoscopic surgery;Pregnancy

多囊卵巢综合征（PCOS）是以稀发排卵或无排卵、高雄激素或胰岛素抵抗、多囊卵巢为特征的内分泌紊乱症候群，临床表现包括月经稀发或闭经、慢性无排卵、不孕、多毛及痤疮等[1]。PCOS患者因持续无排卵，严重情况下会使子宫内膜过度增生，增加罹患子宫内膜癌的风险[2]。在女性卵巢中，每个月有多个卵泡发育，但仅有1个优势卵泡，其余卵泡闭锁，这是通过颗粒细胞凋亡机制实现[3]。Das等[4]报道，PCOS患者卵巢颗粒细胞可能存在不正常的细胞凋亡调控而引起PCOS。Bcl-2 可阻止凋亡形成因子如细胞色素C等从线粒体释放出来，具有抗凋亡作用。Bax可与线粒体上的电压依赖性离子通道相互作用，介导细胞色素C的释放，具有促凋亡作用。p53可以上调Bax的表达水平，以及下调Bcl-2的表达共同完成促进细胞凋亡作用。腹腔镜下双侧卵巢打孔术主要用于对氯米芬抵抗PCOS患者的治疗，二甲双胍可降低雄激素水平，利于卵泡发育[5]。本研究收集对氯米芬抵抗PCOS患者卵巢打孔术取得的卵巢组织，检测颗粒细胞的凋亡调控蛋白Bcl-2、Bax、p53分布与表达，并与非PCOS患者的卵巢组织作对比，对PCOS者予二甲双胍治疗，随访观察Bax阳性者与阴性者的1年临床妊娠率，分析PCOS卵巢颗粒细胞凋亡调控蛋白Bcl-2、Bax、p53的表达及其意义。

对象与方法

一、研究对象

收集2009至2016年在我院行腹腔镜下卵巢打孔术的35例PCOS患者作为PCOS组，患者年龄22 ～ 38岁、中位年龄26岁，不孕年限1 ～ 4年、中位不孕年限2年，原发性不孕26例、继发性不孕9例。35例PCOS患者均符合2003年鹿特丹会议PCOS诊断标准，患者丈夫行精液常规检查未见异常，术前经子宫输卵管造影术排除输卵管阻塞，经氟米芬促排卵治疗3 ～ 6个疗程及螺内酯降雄激素治疗均未妊娠。另收集同期在我院因良性卵巢囊肿或子宫肌瘤行腹腔镜下卵巢囊肿或肌瘤剥离术的30例非PCOS患者作为对照组，患者年龄25 ～ 39岁、中位年龄28岁，术前3个月内未使用任何激素类药物，并于卵泡期手术。所有病例均排除库欣综合征、分泌雄激素的肿瘤、先天性肾上腺皮质增生。本研究经医院医学伦理委员会批准，入组者均签署知情同意书。

二、方 法

1. 标本染色

收集2组患者术中取得的卵巢石蜡包埋组织块，重新进行4 μm 厚连续切片，采用链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶连接（SP）法行免疫组织化学染色（免疫组化）。Bcl-2、Bax、p53一抗及SP免疫组化试剂盒均为丹麦Dako公司产品，购自福州迈新生物技术有限公司，按试剂盒说明书要求操作。

2. 免疫组化半定量分析

由2位副高或以上职称病理科医师采用双盲法评价免疫组化结果，在电子显微镜400倍视野下计数切片内所有颗粒细胞和免疫组化阳性的颗粒细胞，计算同一染色强度的阳性颗粒细胞数占颗粒细胞总数的百分比（pi），并对染色强度（i）进行评分：细胞浆内无棕色颗粒出现为0分，细胞浆内有较浅的棕色颗粒出现为1分，细胞浆内有清晰棕色颗粒出现为2分，细胞浆内有明显棕色颗粒出现为3分。组织学积分=Σpi （i+1），其中“1”为纠正系数，组织学积分最高为4，以组织学积分>3分为阳性，反之为阴性[6]。

3. 观察内容

收集2组患者的年龄、不孕年限等一般资料，以及PCOS组术前及术后首次月经第2 ～ 5 d的卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇、睾酮等临床资料，PCOS组患者术后规律服用二甲双胍1 500 mg/d，对其进行为期1年的随访，对比Bax阳性与Bax阴性患者的1年临床妊娠率差异。

三、统计学处理

采用SPSS 20.0 处理数据。正态分布的计量资料以表示，组内腹腔镜术前术后比较采用配对t检验，组间比较采用成组t检验;非正态分布的计量资料以中位数（四分位数间距）表示，组内腹腔镜术前术后比较采用符号秩和检验。计数资料以百分率表示，组间比較采用Fisher确切概率法。P < 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、35例PCOS患者在腹腔镜术前、术后的FSH、LH、雌二醇及睾酮比较

PCOS组患者的FSH、雌二醇在腹腔镜术前、术后比较差异均无统计学意义（P均> 0.05），术后LH、睾酮均低于术前（P均 < 0.05）。

二、PCOS组与对照组卵巢组织切片的Bcl-2、Bax和p53免疫组化结果比较

1. 镜下所见

PCOS组的Bax阳性颗粒细胞主要见于囊性卵泡壁，呈小片状分布（图1A），卵巢上皮间质也有少量散在分布。对照组Bax阳性颗粒细胞较少，散在分布于卵巢上皮间质（图1B）。2组的Bcl-2阳性颗粒细胞数量均较少，PCOS组主要见于囊性卵泡壁（图1C）。PCOS组的p53阳性颗粒细胞主要散在分布于小卵泡壁（图1D），对照组的p53阳性颗粒细胞多为散在分布（图1E）。

2. 定量分析

PCOS组的Bax及p53蛋白的组织学积分均高于对照组（P均< 0.05），2组Bcl-2蛋白的组织学积分比较差异无统计学意义（P > 0.05）。

三、PCOS患者中Bax阳性者与Bax阴性者的1年临床妊娠率比较

35例PCOS患者中，Bax阳性28例、阴性7例。术后随访1年，18例（51%）成功妊娠，其中Bax阳性17例、阴性1例。Bax阳性者的1年临床妊娠率为61%，Bax阴性者的1年临床妊娠率为1/7。Bax阳性者的1年临床妊娠率高于Bax阴性者（P = 0.041）。

讨 论

随着腹腔镜微创技术的发展及普及，对于有手术指征及不愿应用促性腺激素的氯米芬抵抗PCOS患者，可行腹腔镜下双侧卵巢打孔术。研究显示，腹腔镜下卵巢打孔术可改善PCOS月经周期，改善卵巢局部异常的因素，降低卵巢的张力，打开增厚的卵巢包膜，改善卵巢的微循环，从而诱导自发排卵[5]。PCOS以无排卵和高雄激素血症为特征。一般认为，LH偏高与内分泌紊乱有关，而LH偏高可能导致卵巢功能失调，卵泡难以成熟和破裂[7]。本研究显示，腹腔镜双侧卵巢打孔术后PCOS患者的睾酮有所下降，提示患者的高雄激素血症有一定程度的改善。

Dell’Aquila等[8]报道，颗粒细胞的凋亡率过高会影响卵母细胞的成熟，并起到重要的作用。有学者认为，颗粒细胞发生大量凋亡，则影响睾酮转化雌激素，导致雄性激素升高，而在高雄激素的作用下，PCOS患者的卵泡发育出现停滞[9]。本研究通过腹腔镜手术进行卵巢活检，结果显示 PCOS组Bax、p53组织学积分高于对照组，提示促凋亡蛋白Bax、p53异常升高可能促进颗粒细胞凋亡。PCOS患者的颗粒细胞凋亡与妊娠相关，颗粒细胞的凋亡率增加会导致不孕，其凋亡率高，则妊娠率低[9]。本研究中，2组卵巢组织颗粒细胞抑凋亡蛋白Bcl-2阳性颗粒细胞少而表达低，提示凋亡调控蛋白Bcl-2/Bax之间失衡对颗粒细胞凋亡有影响[8]。二甲双胍是改善PCOS胰岛素抵抗的常用药物[10]。动物实验显示，二甲双胍通过增加PCOS大鼠卵巢颗粒细胞 中Bcl-2的表达及下调Bax的表达，抑制颗粒细胞凋亡，从而促进PCOS大鼠的排卵[11]。本研究对PCOS组35例患者经腹腔镜手术治疗后予口服二甲双胍治疗，1年内有16例患者自然妊娠，1年临床妊娠率为61%，其中Bax阳性者的1年临床妊娠率高于Bax阴性者。限于本研究中p53阳性者例数较少，无法分析p53阳性对临床妊娠率的影响，这有待日后加大样本量完善研究结果。

综上所述，凋亡调控蛋白Bax、p53可能参与PCOS患者卵巢颗粒细胞的凋亡。腹腔镜下双侧卵巢打孔术治疗PCOS可有效降低患者体内雄激素及LH水平，术后卵巢组织活检若颗粒细胞的凋亡调控蛋白染色明显异常，需加强药物治疗，以提高PCOS患者的妊娠成功率。

参 考 文 献

[1] 陈莉莉. 自拟加味桂枝茯苓汤在多囊卵巢综合征患者中的临床疗效观察. 新医学， 2014， 45（8）： 547-550.

[2] Harris HR， Terry KL. Polycystic ovary syndrome and risk of endometrial， ovarian， and breast cancer： a systematic review. Fertil Res Pract，2016，2：14.

[3] Mikaeili S， Rashidi BH， Safa M， Najafi A， Sobhani A， Asadi E， Abbasi M. Altered FoxO3 expression and apoptosis in granulosa cells of women with polycystic ovary syndrome. Arch Gynecol Obstet，2016，294（1）：185-192.

[4] Das M， Djahanbakhch O， Hacihanefioglu B， Saridogan E， Ikram M， Ghali L， Raveendran M， Storey A. Granulosa cell survival and proliferation are altered in polycystic ovary syndrome. J Clin Endocrinol Metab， 2008， 93（3）：881-887.

[5] 周彩云.腹腔鏡下卵巢打孔术联合二甲双胍治疗难治性多囊卵巢综合征不孕疗效观察.实用中西医结合临床，2017，17（5）：81-82.

[6] 刘润侠，刘艳巧.补肾活血方对子宫内膜异位症不孕患者子宫内膜的影响.中国中医药信息杂志，2005，12（6）：14-15.

[7] 杨建辉，徐秀燕，李秀英. 来曲唑对多囊卵巢综合征患者促排卵的临床初步探讨.新医学 ， 2009， 40（3）： 173-175.

[8] Dell’Aquila ME， Albrizio M， Maritato F， Minoia P， Hiichs K. Meiotic competence of equine oocytes and pronucleus formation after intracytoplasmic sperm injection （ICSI） as related to granulosa cell apoptosis. Biol Reprod，2003，68（6）：2065-2072.

[9] 孙春玲，乔杰，陈英玉， 张婷，胡振兴.体外受精-胚胎移植中多囊卵巢综合征颗粒细胞凋亡与妊娠结局关系的探讨.中国实用妇科与产科杂志，2007，23（9）：695-697.

[10] 张二红，黎小妍，徐芬，张添松，古健. 二甲双胍改善多囊卵巢综合征大鼠胰岛素敏感性的机制. 中山大学学报（医学科学版）， 2014， 35（6）：839-844.

[11] 范从红，李根，廖晓燕， 辜定钎，曹丽丽.二甲双胍对多囊卵巢综合征大鼠排卵及卵巢颗粒细胞中B淋巴细胞瘤-2和兔抗人单克隆抗体表达的影响.中国妇幼保健，2017，32（24）： 6277-6281.

（收稿日期：2018-08-29）

（本文编辑：林燕薇）