链霉菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｚ９２发酵液的抗真菌谱及稳定性

(1．沈阳农业大学植物保护学院，沈阳110161；2．黑龙江大学生命科学学院，哈尔滨150080)

摘要：研究了链霉菌Streptomyces tz92发酵液的抗真菌谱及稳定性｡结果表明，菌株Streptomyces tz92发酵液对水稻纹枯病菌､番茄灰霉病菌等31种植物病原真菌的抑菌圈直径在20 mm以上，其中对水稻纹枯病菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径达52．45 mm；发酵液中的抗菌物质对温度变化､光照､紫外光以及在碱性条件下都比较稳定，但在强酸环境中不稳定；菌株Streptomyces tz92连续传接10代，抑菌活性仍然稳定｡

关键词：链霉菌Streptomyces tz92；发酵液；抗真菌谱；稳定性

中图分类号：S482．2+92文献标识码：B文章编号：0439－8114(2008)06－0671－03

Antifungal Spectrum and Stability of Fermentation Broth of the Strain Streptomyces tz92

JIANG Xiao－fan1，SONG Ying1，ZHAO Xiu－xiang1，DU Chun－mei2，WU Yuan－hua1

(1．Plant Protection College， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110161， China；

2．College of Life Science， Heilongjiang University， Haerbin 150080， China)

Abstract： The antifungal spectrum and stability of fermentation broth of the strain Streptomyces tz92 were studied． The inhibition diameters of the fermentation broth to 31 phytopathogenic fungi， such as Rhizoctonia solani， Botrytis cinerea etc．， were up to 20mm， among which， the inhibition diameter against Rhizoctonia solani was the highest， 52．45mm．The stability of the fermentation broth were tested． The results showed that the antimicrobial substance in the fermentation broth was stable to temperature， light， ultraviolet and alkali，while it is unstable in extreme acid condition． When the strain Streptomyces tz92 was transferred for 10 _generations，the activity of itsfermentation broth was also stable．

Key words： Streptomyces tz92； fermentation broth； antifungal spectrum； stability

不吸水链霉菌辽宁变种(Streptomyces ahygroscopicus var．liaoningensis，编号Streptomyces tz92)，是从沈阳天柱山的土壤中分离得到的一株链霉菌，是沈阳农业大学植物病毒研究室研制开发的新一代农用抗病毒抗生素嘧肽霉素的产生菌｡嘧肽霉素已获准农药临时登记，登记作物为番茄和烟草｡该抗生素对烟草花叶病毒病､番茄病毒病等多种植物病毒病均有明显的防效[1－5]｡同时，应用过程中发现该抗生素不仅对植物病毒病有很好的防效，而且对许多植物真菌病害也有很好的防治作用[6－7]｡本文研究了菌株Streptomyces tz92发酵液的抗真菌谱及发酵液中抗菌物质的稳定性，以便为菌株Streptomyces tz92的进一步开发利用提供理论和实践基础，并为该菌株发酵液中抗真菌组分的分离纯化､结构测定及加工储藏等提供理论参考｡

1材料与方法

1．1材料

1．1．1供试菌株菌株Streptomyces tz92，供试病菌为水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)等31种植物病原真菌，指示菌为烟草赤星病菌(Alternaria alternata)｡以上菌种均由本研究室分离保存｡

1．1．2培养基斜面和平板培养基：PDA培养基(马铃薯200 _g，葡萄糖20 _g，琼脂粉15 _g，蒸馏水

1 000 mL，pH值自然)｡高氏麦麸培养基：麸皮10 _g，可溶性淀粉13．3 _g，葡萄糖6．7 _g，NaCl 0．5 _g，MgSO40．5 _g，KNO3 1g，K2HPO4 0．5 _g，FeSO4 0．005 _g，琼脂粉25 _g，pH值7．0～7．2｡发酵培养基：可溶性淀粉47 _g，花生饼粉22 _g，酵母粉2 _g，(NH4)2SO4 2．7 _g，NaCl 2．7 _g， CaCO3 2．7 _g，pH值7．2｡所有培养基在0．1Mpa下灭菌30 min备用｡

1．2方法

1．2．1发酵液制备在无菌条件下，用无菌水制成菌株Streptomyces tz92孢子悬浮液，高氏麦麸培养基上每皿加入0．5 mL菌悬液，无菌铲刮均匀，置于28℃恒温培养箱中培养4 d，待菌落表面颜色变为深灰色后表明大部分孢子已成熟，即可用于发酵｡在无菌条件下直接将带菌种的培养基分割装入加有定量液体培养基的三角瓶中，用透气封口膜封口，置于28℃､140 r·min^－1的条件下振荡培养96 h，用纱布滤除菌丝体，再在4 000r·min^－1常温条件下离心15 min，收集上清液备用｡

1．2．2杯碟法测定发酵液抗真菌谱先在培养皿中倒入10 mL琼脂培养基，凝固后再加入10 mL含有各病原菌孢子或菌丝悬液的培养基，待凝固后在每个培养皿上轻轻放置1个灭菌牛津杯，每个牛津杯中加入200 μL发酵液，每个处理重复3次，置于28℃恒温培养箱中培养48～96 h后测量抑菌圈直径，取平均值[8]｡

1．2．3发酵液中抑菌物质稳定性的测定

1)温度稳定性｡将发酵液进行以下两种处理：①将发酵液于50､60､70､80､90､100､121℃下分别处理0．5､1､1．5､2､2．5､3 h，以烟草赤星病菌作为指示菌，未处理发酵液作为对照，杯碟法测定其抑菌圈直径，根据抑菌圈直径变化情况来确定其热稳定性，每个处理重复3次｡②取4份发酵液，每份2 mL，装入封口离心管中，分别放在－20､4､28､55℃恒温条件下保存30 d，杯碟法测定其抑菌圈直径，每个处理重复3次｡

2)酸碱稳定性｡取10份发酵液，每份2 mL，分别用1 mol·L^－1 HCl､1 mol·L^－1 NaOH将样品分别调成pH值1～10，以烟草赤星病菌作为指示菌，未处理发酵液作为对照，杯碟法测定其抑菌圈直径，根据抑菌圈直径变化情况来确定其酸碱稳定性，每个处理重复3次｡

3)光稳定性｡将发酵液置于4 000lux的光照箱中分别照射2､4､6､8､10､12 h，以烟草赤星病菌作为指示菌，未处理发酵液作为对照，杯碟法测定其抑菌圈直径，根据抑菌圈直径变化情况来确定其光稳定性，每个处理重复3次｡

4)UV稳定性｡15 w紫外灯下，距离20 cm处，将发酵液放在紫外线下照射0．5､1､1．5､2､2．5､3 h，以烟草赤星病菌作为指示菌，未处理发酵液作为对照，杯碟法测定其抑菌圈直径，根据抑菌圈直径变化情况来确定其UV稳定性，每个处理重复3次｡

1．2．4菌株的传代稳定性将菌株Streptomyces tz92在高氏麦麸培养基上每隔两天传代1次，连续传10代，然后测定各代菌株发酵液对烟草赤星病菌的抑菌活性，每个处理重复3次｡

2结果与分析

2．1发酵液的抗真菌谱

菌株Streptomyces tz92的发酵液对多种植物病原真菌都有较好的抑菌活性，表明其抑菌谱较广(表1)，对31种植物病原真菌的抑菌圈直径均达20 mm以上｡

2．2发酵液中抑菌物质的稳定性

2．2．1温度稳定性将发酵液在50､60､70､80､90､100､121℃下分别处理0．5､1､1．5､2､2．5､3 h，结果表明，只有在121℃下处理后活性明显下降，其他温度处理后其抑菌活性基本没有变化(表2)，说明发酵液所产生的抑菌物质具有较强的热稳定性｡

将发酵液分别放在－20､4､28､50℃恒温条件下保存30 d，结果表明，发酵液在4℃条件下保存效果最好，而在其他温度条件下保存抑菌活性略有下降｡

2．2．2酸碱稳定性发酵液在pH值4～10条件下抑菌活性基本不变，在pH值1～3条件下抑菌活性明显降低(图1)，发酵液所产生的抑菌物质在强酸条件下稳定性差｡因此，对发酵液中活性物质进行分离纯化时应保持中性或碱性条件下进行｡

2．2．3光稳定性发酵液置于4 000lux的光照箱分别照射2､4､6､8､10､12 h后抑菌活性基本不变，表明发酵液的光稳定性较好｡

2．2．4UV稳定性发酵液经紫外光分别照射0．5､1､1．5､2､2．5､3 h后抑菌活性基本不变，表明发酵液的UV稳定性较好｡

2．3菌株的传代稳定性

将菌株Streptomyces tz92连续培养10代，其发酵液对烟草赤星病菌的抑菌活性没有明显变化，表明该菌株有较好的传代稳定性｡

3结论与讨论

本文测定结果进一步明确了菌株Streptomyces tz92发酵液所产生的活性物质具有明显的抗真菌活性，对引起根部､叶部和苗期病害等31种病原真菌均有较好的拮抗作用｡稳定性研究表明，发酵液杀真菌活性成分对温度､光照､紫外光和强碱均具有良好的稳定性，且菌株Streptomyces tz92传代稳定性较好，显示出该菌株在防治真菌病害方面具有可开发利用的价值｡同时，本文也为该菌株杀真菌有效组分的分离纯化提供了理论依据｡

在农用抗生素中，兼杀真菌和抗病毒的抗生素曾有报道，如井冈霉素是防治水稻纹枯病高效､低毒的理想生物农药，现研究又发现井冈霉素具有一定诱导植株产生系统抗病毒的作用[9^－10]｡宁南霉素不仅适用于防治烟草､番茄等多种作物的病毒病，并且可以兼防白粉病､根腐病､炭疽病等真菌性病害[11^－12]｡本文报道的菌株Streptomyces tz92是农用抗病毒抗生素嘧肽霉素的产生菌，嘧肽霉素是通过有选择性地抑制病毒RNA的复制和蛋白质的合成起到抗病毒作用[2，5]，但其抗真菌活性物质的结构､作用机理还不清楚，因此有必要明确其产生的抗真菌活性物质的分离纯化技术进而明确其结构｡

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